血紅蛋白納米微囊的制備與表征
時間:2005-06-22
趙健 劉昌勝
（華東理工大學 教育部醫用生物材料工程研究中心，上海，200237）
摘要
介紹了W/O/W復乳液法制備血紅蛋白納米微囊，包封率在72%~88%；所制納米微囊的粒徑分布在要求的70~200nm的范圍內，形態規則，大多呈球形；zeta電位表明這種納米微囊表面帶有一定的負電荷，這使粒子不易聚集，對粒子的穩定性有利；另外XRD圖譜表明PCL對血紅蛋白的包埋是有效的。這將為血紅蛋白納米微囊作為人造紅細胞提供一種有效的制備手段。
人血液代用品系指人紅細胞代用品，尤其是以血紅蛋白為基質的納米微囊血液代用品模擬天然紅細胞膜和紅細胞內的生物環境，用仿生的原理將高分子材料作為殼材料，內部包埋血紅蛋白，制備成為“人工紅細胞”，是目前研究最活躍、同時應用領域最廣泛的一類血液代用品。在構建體內長循環納米粒時較好的粒徑范圍為70~200 nm。納米微囊的形態、粒徑、粒徑分布、表面性質、包封率等是影響其體內分布與穩定性的主要因素。本文將介紹血紅蛋白的可生物降解聚合物納米微囊的制備以及關于納米微囊的表征。
實驗方法:
(1)制備 采用復乳液溶劑揮發法制備血紅蛋白的可生物降解聚合物納米微囊。首先將血紅蛋白溶解，配制成內水相加入到5%的PCL的二氯甲烷溶液中，經超聲或高速勻漿乳化成W/O的初乳液，然后順次加入到外水相和分散相中，得W/O/W復乳液，在常溫常壓下連續攪拌，使溶劑完全揮發，制得血紅蛋白納米微囊的混懸液?？瞻孜⒛抑苽溥^程除無血紅蛋白，其余同上?；鞈乙航?0 000 rpm離心1 hr，沉淀微囊、順次洗滌、凍干貯存備用。
（2）表征 包封率的測定，取混懸液經10 000 rpm離心1 hr后的上清液，用分光光度計法測其中血紅蛋白含量W1，設總透料血紅蛋白的量為W，則包封率的表達式如下：包封率EE%= W1/W（%）；粒徑及其分布的測定，取血紅蛋白納米微囊的混懸液適量，加雙蒸水稀釋后，用激光粒度分析儀測定體積平均粒徑，多分散度；zeta 電位測定，取血紅蛋白納米微囊的混懸液適量，分散在 pH不同的緩沖溶液中，用zeta電位儀測定納米微囊的zeta 電位；掃描電鏡觀察，血紅蛋白納米微囊經沉淀、洗滌、凍干后，固定于采樣臺上，在納米微囊表面噴金，然后置于掃描電子顯微鏡下觀察納米粒子的形態；X-射線衍射，采用Rigaku D/max2550 VB/PC。實驗條件為：功率40 kV,100 mA，銅靶，3500 CPS。
數據結果：血紅蛋白納米微囊的粒徑及其分布如圖1所示。從粒徑分布圖上可以看出，只有一個粒徑分布峰，血紅蛋白微囊的粒徑分布在80~200 nm之間，且分布較窄，大部分粒徑集中在100~160 nm的范圍內；SEM觀察結果表明，血紅蛋白納米微囊大多呈球形，表面圓整；Zeta電位測定結果表明血紅蛋白納米微囊在pH大于４時帶有較強的負電荷，這使納米粒之間由于同種電荷的相互排斥作用而不易聚集，從圖上可以看出，pH越大，zeta電位的絕對值越大，也表明越大，對納米混懸液的穩定性越有利。而在體內血液循環的過程中，微弱的pH變化將不會影響血紅蛋白納米微囊的穩定性；血紅蛋白、血紅蛋白同空白微囊的物理混合物以及包埋血紅蛋白的毫微膠囊等3個樣品的XRD圖譜見圖4。血紅蛋白及其同空白微囊的物理混合物的XRD圖譜均呈現非晶態衍射的散漫的“暈環”，而在蛋白微囊的圖譜上這種非晶態的特征不再出現，取而代之的是21.44°、27.439°、31.760°、45.52°和56.56°等共12個特征峰，即有確定 d值的銳衍射峰，這是PCL具有一定結晶性的特征，表明毫微膠囊中的血紅蛋白被包覆于殼材料之中；經測定包封率在72%~88%，說明此方法對血紅蛋白的包埋效率較好。
主要論點和結論：本文對復乳液法制備血紅蛋白納米微囊進行了簡要介紹，并對相關指標進行了測試，得如下結論：所制納米微囊的粒徑分布在要求的70~200 nm的范圍內，形態規則，大多呈球形，zeta電位表明這種納米微囊表面帶有一定的負電荷，這使粒子不易聚集，對粒子的穩定性有利。另外XRD圖譜表明PCL對血紅蛋白的包埋是有效的。這將為血紅蛋白納米微囊作為人造紅細胞提供一種有效的制備手段。
