U学家在zȝ?yu)超分L率成像领域取得重要进?/span>
2015-8-31 来源:中国聚合物网 点击?/span>
关键词：(x)昑־?/a> 分辨率 成像
来自国霍华德休斯医学研I所Janelia研究园、中国科学院生物物理研究所、美国国立科学研I、哈?jng)医学院{的U学家们Q借助其发展的新光学超分L率成像技术，在前所未有的高分L率条件下研究?jin)活体细胞(yu)内的动态生物过E。他们的新方法显著提高(sh)(jin)l构光照明显微镜(structured illumination microscopy, SIM)的分辨率Q一U最适合zM分辨成像的技术?/span>
新技术所拍摄的视频生动地展现?jin)细胞(yu)内蛋白质的q动和相互作用。它们帮助生物学家理解细?yu)是怎样改变它们之间的依存结构，以及(qing)重整l胞(yu)膜结构得细?yu)外的分子可以被吸收到细胞(yu)内。来自Janelia研究园的研究员Eric Betzig、生物物理所新引qPI李栋和他们的合作者基于原有的SIM昑־镜原理新发展?jin)两U新的超分L率成像技术。超分L率光学显微成像技术能够跨理论的分L率极限，在极高的分L率下展现l胞(yu)内的_l构。但是，到目前ؓ(f)止，分辨率昑־镜技术却依然不能q行有效的活体细?yu)成像?/span>
“这些方法设立了(jin)分辨率光学昑־镜的成像速度和非侵入Ҏ(gu)的新标准，它们使得分辨率zMl胞(yu)成像成ؓ(f)现实。”Betzig说道。这一研究成果??8日在国《科学》杂志上以封面文章发表?/span>
在传l的SIM昑־镜中Q物镜下的物体被非均匀的结构光Q类g条纹码）(j)所照明。在实验中，几束不同的结构光用来照明物体Q它们和物体在不同角度频所产生的摩?dng)条U被相机依次采集。然后计机提取摩尔条纹~码的信息ƈ其解码生成三维的高分L率图像。最l重建的SIM囑փh高(sh)传统昑־镜图?倍的I间分L率?/span>
Betzig和其他两位科学家因ؓ(f)发展分辨率荧光昑־镜而被授予2014q诺贝尔化学奖。他说道QSIM昑־镜技术之所以没有得到像其它Ҏ(gu)那样多的x(chng)Q是因ؓ(f)其它技术能够提供比两倍更高的分L率改q效果。但是，他强调SIM拥有两大其它的超分L率方法所没有的优ѝ这些其它方法包括了(jin)两种d获得?dng)奖表嘪的技术：(x)他和同事Harald Hess?006q开发的光激zd位显微镜Qphotoactivated localization microscopy, PALMQ，和受Ȁ辐射耗尽Qstimulated emission depletionQSTEDQ显微镜。但是，q两U技术都需要过多或q强的光来照明样品，以至于荧光蛋白很快被漂白Q细?yu)样品很快被损害Q从而不可能长时间进行成像。然而，SIM在这些方面不一P“我׃?jin)SIMQ因为它的速度很快Q而且它所需的照明光强度q远于其它Ҏ(gu)。”Betzig说道?/span>
Betzig?011qMats GustafssonM后不久开始与SIM相关的研I。Gustafsson是SIM技术的先驱之一Q生前也是Janelia的研I员。Betzig那时已经׃SIM有潜力ؓ(f)解析l胞(yu)内部的工作机理提供重要的见解Q如果SIM的空间分辨率可以被提高，它对于生物研I的可用性将被大大增强?/span>
在生前，Gustafsson和博士生Hesper Rego发展?jin)一U利用饱和耗尽Qsaturated depletionQ的非线性SIM技术，但这U技术在改进分L率的同时需要用很多的光照q且散失?jin)SIM成像速度快的优势。Betzig惛_?jin)一U可以避免这些缺L(fng)Ҏ(gu)?/span>
饱和耗尽非线性SIM利用光可反复开关的荧光蛋白和其在开兌E中的饱和耗尽效应来提高分辨率。它产生囑փ的过E是Q首先把所有的荧光蛋白分子Ȁzd可发光的状态（亮态）(j)Q然后用一束结构光把大部䆾的亮态分子反Ȁzd暗态。通过l构光反ȀzM后，仅有数处于l构光最弱区域的分子仍然保持在亮态。这些光调控q程提供?jin)物体的高空间频率信息，从而让囑փ更加清晰。这一q程需要重?5或更多次才能产生最l的高分辨率囑փ。Betzig说道Q这一原理非常cM于STED或另一U与其相关的叫做RESOLFT的超分L率技术的原理?/span>
q一技术ƈ不适合于活体成像，因ؓ(f)Ȁzd反激z荧光蛋白需要很长的旉。另外，反复的光照明?x)对l胞(yu)和荧光蛋白本w造成损伤。Betzig说道Q“这一技术的问题在于你首先用光激zM(jin)所有的荧光蛋白分子Q然后你马上又用另一束光反激zM(jin)大部份分子。这些被反激zȝ分子Ҏ(gu)l的囑փ没有M贡献Q但却被你用光‘a(b)炸’了(jin)两次。你让分子承受了(jin)很大‘压力’，q且׃(jin)很多你ƈ没有的时_(d)因ؓ(f)q段旉内细?yu)在q动。?/span>
解决Ҏ(gu)其实很简单，Betzig说道Q“没有必要激zL有的分子。”在Betzig研究组新发展的l构光激z非U性SIM的技术中Q一开始用l构光只ȀzL品里的一部分荧光蛋白分子。“这一l构光激z过E已l给你一些高分L率的信息?jin)。”Betzig解释道。另外一束结构光用于反激zd子，额外的信息可以在反激zȝq程中同时被d。两个结构光叠加的效应给与最l图?2U米的分辨率Q这一l果好于原始的SIMQƈ且把由光波长军_的传l分辨率极限改进?jin)三倍?/span>
“我们能够做到快速地高分L率成像。”Betzig说道。这很重要，他补充道Q因为对于动态过E，单纯提高I间分L率而没有相应地提高成像速度是没有意义的。“如果细?yu)内部有的结构?微米每秒的速度q动Qƈ且我?微米的分辨率Q那么我需要在一U内采集囑փ。但如果我有1/10微米的分辨率Q那么我必需?/10U内采集囑փQ不然图像将变得模糊。”Betzig解释道?/span>
l构光激z非U性SIM可在1/3U内采集25q原始图像，q从中重建出一q高分L率图像。它的图像采集很高效Q只需用较低的照明光强Qƈ且收集每一个亮态荧光蛋白分子所携带的信息。从而有效地保护?jin)荧光分子，使得昑־镜能够进行更长时间的成像Q让U学家们可以观测到更多的动态活动?/span>
该成像技术（PA NL-SIMQ的实现需要一c能被反复光Ȁzȝ荧光蛋白。合作者生物物理所徐^勇课题组发展?jin)一U新型反复光Ȁz荧光蛋白Skylan-NSQ对比现有的其它反复光激zȝ荧光蛋白Q该蛋白h高对比度、高光学E_性等Ҏ(gu)。“Skylan-NS显著改进?jin)这些对非线性SIM来说臛_重要的特性，使得我们在技术方面的创新能够体现得淋漓尽致。回超分L率显微镜的发明和发展q程Q新颖的荧光探针一直扮演关键角Ԍ在这一工作中也不例外。”李栋说道?/span>
在Scinece论文中利用该探针和结构光Ȁz非U性SIM技术获得了(jin)在细?yu)运动和改变形状的过E中骨架蛋白的解体和自n再组装过E，以及(qing)在细?yu)膜表面的叫做caveolae的微内吞体动态过E的影像。此外，Betzig的团队还利用?jin)已l商业化的高数值孔径物镜将传统SIM的空间分辨率提高?4U米。高数值孔径限制了(jin)被光照明的样品范_(d)从而降低了(jin)光对l胞(yu)以及(qing)荧光蛋白分子的损伤。这一Ҏ(gu)可以同时对多个颜色通道q行成像Q得科学家们可以同时跟t几U不同蛋白质的活动?/span>
通过高数值孔径的Ҏ(gu)QBetzig的团队观了(jin)多个骨架蛋白质在形成_着斑（链接l胞(yu)内外的物理链Q过E中的运动和怺作用。他们也q踪?jin)clathrin修饰的内吞体的成长和内吞q程Q内吞体细?yu)外的分子{Udl胞(yu)内）(j)。他们的定量分析回答?jin)几个不能被以往的成像技术所解决的问题，例如Q内吞体的分布，以及(qing)内吞体尺寸和寿命之间的关pR最后，通过l合高数值孔径方法和l构光激z非U性SIMQBetzig和他的同事可以在高分L率条件同时追t两U蛋白质的活动?/span>
李栋为生物物理所今年新引q的PIQ回国后在生物物理所搭徏q套成像pȝQ目前正在进一步提高SIM技术。李栋希望广泛与国内外生物学家合作，一h索该技术潜在的应用?/span>
该工作受到国家?73”计划、国家自然科学基金、北京市(jng)自然U学基金{的资助?/span>
囄Q两U方法提高活l胞(yu)昑־成像的分辨率。左图：(x)双色高数值孔径物镜的全内反射l构光显微成像技术（high NA TIRF-SIMQ。Ԍ(x)Ȁ动蛋白（actinQ；l色Q内吞小泡（CCPQ。右图：(x)Z非线性激zSkylan-NS标记的激动蛋白的非线性结构光照明QPA NL-SIMQ成像?/span>
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