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圖1 基于喹啉螺旋的人工質子跨膜通道示意圖

  日前，杭州師范大學材料與化學化工學院劉俊秋教授團隊在Nano Letters上發表題為“Unimolecular Helix-Based Transmembrane Nanochannel with a Smallest Luminal Cavity of 1 ? Expressing High Proton Selectivity and Transport Activity”的通訊研究論文。

  眾所周知，天然通道蛋白可以利用其獨特的過濾結構實現對特定離子的高選擇性跨膜傳遞。例如，天然鉀離子通道KcsA是一種由四股螺旋組成的倒錐形結構，其內部最小尺寸為2.8 ?與鉀離子尺寸高度匹配，能夠有效的實現對鉀離子的高選擇性傳遞，并通過尺寸效應阻止其它離子的跨膜傳輸。受此啟發，研究人員利用喹啉螺旋構建了一種內徑約為1 ?的單分子人工質子跨膜通道，由于質子的尺寸非常小，可以輕易地通過該納米孔道進行跨膜傳遞。而其它陰、陽離子以及水分子等由于具有較大的空間尺寸則被有效地排除在外（圖1）。理論分析表明，該喹啉螺旋的十六聚體（16mer）的高度約為2.5 nm，能夠以單分子形成嵌入磷脂膜的疏水層當中并介導質子的跨膜傳遞。而長度較短的四聚體（4mer）和八聚體（8mer）則沒有表現出明顯的質子跨膜傳遞性能。以往的人工質子通道通常是利用孔道內連續的水線結構實現質子的跨膜傳遞，在這個過程當中盡管可以排除其它離子的通過，但是卻無法阻止水分子的傳輸。而該基于人工螺旋的質子通道內徑僅有1 ?，可以同時將其它離子以及水分子排除在外，實現真正意義上的高選擇性質子跨膜傳遞（圖2）。

圖2 喹啉螺旋的化學式與空間結構

  隨后，研究人員又利用氫-氘交換核磁共振對該質子通道的傳輸機理進行了詳細分析。首先采用溶解性更好的S-4mer作為研究對象，將其溶解到DMSO-d₆、CDCl₃和D₂O的混合溶劑當中，向溶液中加入少量的氘代鹽酸（DCl·D₂O），然后監測螺旋內部活潑氫的變化。結果表明，螺旋空腔內部與亞甲基相連NH_b上的H與氘代鹽酸中的D迅速發生交換，而NH_a上的氫原子的相對較為穩定，隨后，從8mer和16mer的氫-氘交換實驗中也得到了相同的實驗結果。以上結果說明通道內連續NH_b結構在質子跨膜傳遞過程當中起到了關鍵的作用。溶液中水合的質子通過與NH上的活潑氫進行交換，并利用磷脂膜兩側質子濃度差為驅動快速實現選擇性跨膜傳遞（圖3）。

圖3 喹啉螺旋進行質子傳遞的機理研究

  最后，利用單分子膜片鉗實驗對16mer的質子傳遞性能進行深入分析，并采用天然的短桿菌肽A作為對照樣品（短桿菌肽A可以利用其內部連續水線進行質子跨膜傳遞）。研究表明在相同的條件下，16mer對質子的跨膜傳輸速率達到驚人的10⁷ H⁺?s^-1?channel^-1與短桿菌肽A的質子傳輸速率達到同一個數量級。然后通過在雙層膜的trans和cis室內加入不同的電解質溶液（NaCl、KCl、HCl）并在磷脂膜兩側施加不同的電壓測得其反轉電位（V_rev），利用該值以及Goldman-Hodgkin-Katz 方程可以計算出16mer通道分子對H⁺和Na⁺，K⁺，Cl^-的滲透選擇性比值分別為225.1, 74.8和99.6（圖4）。該基于喹啉螺旋的跨膜通道為迄今已知內徑最小的人工納米孔道結構。此外，該工作還發現了一種基于連續NH基團實現質子跨膜傳輸的新機制。該研究結果對于理解和模擬天然離子通道的傳輸行為具有重要的生物學意義，也為今后開發人工離子通道在生物醫藥領域的潛在應用提供了全新的思路。

圖4 人工質子跨膜通道的膜片鉗單通道電流信號

  杭州師范大學材料與化學化工學院博士后研究人員閆騰飛為論文的第一作者，通訊作者為青年教師孫鴻程博士、于雙江特聘教授和劉俊秋教授。該研究工作得到了國家科技部重點研發計劃項目（2020YFA0908500, 2018YFA0901600）和國家自然科學基金（22001054, 22075065）的支持。

  論文連接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.1c03858