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  近日，中比先進生物醫(yī)用材料聯(lián)合實驗室（南京林業(yè)大學-根特大學）熊燃華教授，Stefaan C. De Smedt院士及Kevin Braeckmans教授在Nature Communications上在線發(fā)表了題為“Light triggered nanoscale biolistics for ef?cient intracellular delivery of functional macromolecules in mammalian cells”（DOI: 10.1038/s41467-022-29713-7）的研究型論文。他們開發(fā)了一種新型納米粒表面荷載納米彈丸的“納米炸彈”，揭示了其與光協(xié)同生成納米微泡“推動”生物大分子進入胞內(nèi)的高效遞送機制，顯著提高了大粒徑生物大分子（如mRNA、pDNA）的遞送效率，實現(xiàn)了高通量、高效的胞內(nèi)遞送。中比先進生物醫(yī)用材料國際聯(lián)合（南京林業(yè)大學-根特大學）實驗室熊燃華教授、Stefaan C. De Smedt院士和Kevin Braeckmans教授為通訊作者。

  向活細胞內(nèi)遞送功能生物大分子是生物醫(yī)學領域的一個重要研究方向，例如，細胞免疫療法需要在體外通過胞內(nèi)遞送技術，將生物大分子如核酸等遞送到細胞內(nèi)，得到功能免疫細胞；然后將其回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，實現(xiàn)免疫細胞對癌細胞產(chǎn)生特異性識別，達到精準殺傷癌細胞的目的。然而，生物大分子向胞內(nèi)遞送過程需要克服細胞膜造成的系列障礙如細胞攝取、胞內(nèi)釋放等。傳統(tǒng)的胞內(nèi)遞送方法難以兼顧細胞處理通量、遞送效率、遞送安全等問題。因此，如何創(chuàng)建高通量、高效、安全的生物大分子胞內(nèi)遞送新材料及技術是需要解決的關鍵科學問題，對生物醫(yī)學領域的發(fā)展具有重要的意義。

  光作用的胞內(nèi)遞送方法具有較好的通用性和調(diào)控性，尤其適用于在離體情況下遞送各種生物大分子到各類細胞內(nèi)。將激光束聚焦于細胞膜，可在細胞膜上短暫地形成微小膜孔，生物大分子通過膜孔自由擴散進入胞內(nèi)，實現(xiàn)胞內(nèi)遞送過程。然而，如何將光束“手動”聚焦到僅有幾納米厚的細胞膜上，并形成幾百納米范圍的膜孔異常困難，實驗操作的復雜性極大限制了細胞處理通量和該方法的進一步應用。為了解決這一難題，他們提出了納米粒與光協(xié)同增強胞內(nèi)遞送的方法，通過黏附在細胞上的納米粒將光協(xié)同效應“自動”聚焦于細胞膜，進行高通量的快速精準“開孔”，局部增強細胞膜滲透性，將細胞處理通量從每分鐘數(shù)十個顯著地提高到每分鐘百萬個，實現(xiàn)了高通量的胞內(nèi)遞送。他們利用具有良好細胞黏附能力的陽離子聚合物與光吸收功能較好的納米顆粒（如納米金、石墨烯量子點、黑磷量子點等）之間的相互吸附效應，制備了一系列改性光吸收納米顆粒。首先，將陽離子聚二烯二甲基氯化銨修飾在金納米顆粒表面，制備了具有良好細胞黏附性的金納米粒；發(fā)現(xiàn)在強激光能量密度協(xié)同作用下，金納米粒迅速吸收光能轉化成熱能，誘導生成納米微泡并在細胞膜上高通量地快速精準“開孔”，細胞外的生物大分子通過“膜孔”滲透到細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)胞內(nèi)遞送過程。該遞送策略不僅保障了細胞的高通量處理，而且將小干擾核酸（siRNA）遞送效率從傳統(tǒng)熱作用的40%提高到80%，顯著增強了抑制蛋白表達的生物功能（ACS Nano，2014，8，6288–6296）。

  為了促進納米粒與光協(xié)同增強的胞內(nèi)遞送技術向臨床應用快速轉化，應避免納米粒與細胞直接接觸導致納米粒“侵入”細胞。針對該難題，他們提出了聚合物薄膜“錨定”納米粒的設計策略，即通過旋涂成型工藝將納米粒嵌入聚合物薄膜內(nèi)，再與光協(xié)同引發(fā)納米微泡效應，促進黏附或生長在薄膜上的細胞產(chǎn)生局部精準破膜，增強細胞滲透性，實現(xiàn)納米粒“非侵入”細胞的安全胞內(nèi)遞送（Adv. Mater., 2021, 33, 2008379）。然而，基于旋涂工藝制備的“實體”聚合物薄膜的膜內(nèi)孔隙率低、孔徑小，可能會限制功能生物大分子的胞內(nèi)遞送效率。基于他們近年來在靜電紡絲領域積累的研究成果，進一步提出了靜電紡絲納米纖維“錨定”納米粒的新策略，創(chuàng)建了復合納米纖維膜與光協(xié)同增強且納米粒“非侵入”細胞的胞內(nèi)遞送新方法，不僅顯著地將免疫T細胞的siRNA胞內(nèi)遞送效率從10%提高至40%，而且同時保證了免疫細胞的生物功能特性完好無損，為難以兼顧處理通量、效率、安全的胞內(nèi)遞送難題提供了有效解決方法（如圖1，Nat. Nanotechnol., 2021, 16, 1281）。具體地，利用靜電紡絲技術制備了內(nèi)嵌四氧化三鐵光敏納米粒的聚己內(nèi)酯（PCL）復合納米纖維膜。在生物大分子遞送過程中，分散在溶液中的大分子可在高孔隙率、大孔徑的納米纖維薄膜中迅速擴散，極大提高了大分子在細胞膜局部破膜處的濃度，從而提高了遞送效率。同時，質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)處理后的細胞體內(nèi)鐵元素含量與對照組無顯著差別，證明了該過程是納米粒“非侵入”細胞內(nèi)的安全遞送。通過遞送siRNA功能化的免疫T細胞，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制效果。

  為了提高大粒徑生物大分子如信使核糖核酸（mRNA）、質(zhì)粒脫氧核糖核酸（pDNA）的胞內(nèi)遞送效率，他們進一步提出了復合納米粒與光協(xié)同生成納米微泡“推動”生物大分子進入細胞內(nèi)的遞送新思路，與傳統(tǒng)依靠分子“被動擴散”進入細胞的遞送方法相比，發(fā)現(xiàn)mRNA、pDNA胞內(nèi)遞送效率分別顯著提高了約6倍和8倍（如圖2）。

圖2  復合納米粒與光協(xié)同生成納米微泡“推動”生物大分子進入胞內(nèi)的遞送示意圖

  具體地，通過在納米粒表面荷載納米彈丸，合成了一種新型復合納米粒結構的“納米炸彈”；在光協(xié)同作用下，納米粒快速吸收光能轉化成熱能，誘導生成納米微泡，形成“爆炸”推力，推動其表面荷載的納米“彈丸”局部穿破細胞膜，但該局部破膜作用尚不會對細胞的主體結構產(chǎn)生整體影響，從而安全地“推動”分散在溶液中的生物大分子進入到細胞內(nèi)，實現(xiàn)高通量、高效的生物大分子胞內(nèi)遞送。

圖3  由四氧化三鐵核納粒和200 nm聚苯乙烯納米球組成的200-“納米炸彈”的合成、表征和激光引發(fā)。  

圖4  200-“納米炸彈”激光引發(fā)及其與細胞相互作用的實驗和理論研究。  

圖5  應用200-“納米炸彈”向貼壁細胞HeLa和懸浮細胞Jurkatm胞內(nèi)遞送功能生物大分子RNA和pDNA。

  全文鏈接： https://doi.org/10.1038/s41467-022-29713-7

  實驗室主頁：https://www.x-mol.com/groups/nfu-ugent