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  近日，廣東省人民醫(yī)院張余教授與華中科技大學(xué)楊光教授和武漢大學(xué)蔣序林教授合作開(kāi)發(fā)了一種可注射水凝膠/多孔微球復(fù)合載藥的可控釋放體系，通過(guò)構(gòu)建組織修復(fù)的免疫微環(huán)境促進(jìn)骨和軟骨的再生重建，是一種具有極高應(yīng)用前景的軟骨修復(fù)策略。

  損傷軟骨缺損的纖維修復(fù)和軟骨下骨的不適當(dāng)再生可導(dǎo)致再生軟骨的退變，最終導(dǎo)致軟骨修復(fù)的失敗，目前尚未有效的解決手段。近年來(lái)，基于免疫細(xì)胞調(diào)控促進(jìn)組織修復(fù)正在成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。為了探索免疫調(diào)節(jié)類(lèi)的生物材料在骨軟骨再生中應(yīng)用的可行性和科學(xué)性，本研究中研發(fā)了一種由多孔殼聚糖（CS）微球和羥丙基甲殼素（HPCH）水凝膠組成的具備巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)和可注射性能的 "積木式 "可控藥物遞送系統(tǒng)，其中二甲氧基甘氨酸（DMOG）負(fù)載于在溫敏HPCH水凝膠（HD）中，而Kartogenin（KGN）接枝于多孔CS微球（CSK-PMS）。研發(fā)的HD/CSK-PMS復(fù)合支架可有效地調(diào)節(jié)缺損部位的再生微環(huán)境，募集自體干細(xì)胞并提供豐富的細(xì)胞黏著位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)局部巨噬細(xì)胞的M2極化并促進(jìn)骨軟骨的再生。可快速降解的HD有利于透明軟骨再生，而高穩(wěn)定性的CSK-PMS則支持軟骨內(nèi)骨化和軟骨下骨的再生，為再生軟骨提供支撐。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)顯示基于HD/CSK-PMS分層結(jié)構(gòu)的可控藥物輸送組合可有效調(diào)控M2巨噬細(xì)胞微環(huán)境，并促進(jìn)軟骨缺損原位骨軟骨的再生。進(jìn)一步通過(guò)組織染色、破骨Trap染色和免疫組化探索免疫調(diào)節(jié)類(lèi)組織工程材料促進(jìn)骨軟骨重建的機(jī)制。本研究結(jié)果揭示免疫微環(huán)境和軟骨下骨對(duì)高質(zhì)量軟骨修復(fù)的重要性，因此，基于免疫調(diào)節(jié)的水凝膠/PMS復(fù)合體系可能是一種具備極高應(yīng)用前景的骨軟骨再生策略。

圖1. 復(fù)合體系促進(jìn)骨軟骨修復(fù)的示意圖

  在這項(xiàng)工作中，作者首先構(gòu)建了多孔殼聚糖微球和具備溫敏性能的羥丙基甲殼素水凝膠，通過(guò)EDC-NHS化學(xué)方法將疏水性KGN接枝到具備豐富表面積的多孔微球表面及孔隙中，同時(shí)采用物理包埋的方式將親水性的DMOG負(fù)載至水凝膠中，多種載藥方式可實(shí)現(xiàn)親疏水藥物的可控釋放。進(jìn)一步通過(guò)FTIR、電鏡、流變儀和藥物釋放等實(shí)驗(yàn)對(duì)對(duì)該復(fù)合體系及其藥釋規(guī)律進(jìn)行了表征。

圖2. 多孔微球及溫敏水凝膠載藥復(fù)合系統(tǒng)的制備及材料表征

  隨后，作者通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究了復(fù)合體系對(duì)干細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的募集作用及其直接和間接促軟骨分化的影響。CCK8、細(xì)胞骨架及電鏡結(jié)果表面多孔微球具備良好的生物相容性和細(xì)胞粘附性，微球個(gè)體間可通過(guò)表面的細(xì)胞互相連接，以“積木”的方式構(gòu)建組織模塊。

圖3. 多孔微球的細(xì)胞黏附和“積木”式組織模塊

  進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明復(fù)合支架可以通過(guò)激活CCL2和MIF基因募集干細(xì)胞。同時(shí)基于電鏡、組織細(xì)胞染色和細(xì)胞外基質(zhì)成份分析闡明復(fù)合體系具備直接促進(jìn)干細(xì)胞軟骨分化的作用，還可以通過(guò)巨噬細(xì)胞的刺激間接促進(jìn)軟骨生成。

圖4. 復(fù)合體系的直接和間接促軟骨分化作用

  繼而以流式細(xì)胞分析、RT-PCR、Elisa和皮下植入的免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)探究了復(fù)合體系對(duì)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響。結(jié)果表明復(fù)合體系可以有效地調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的M2極化，其中DMOG是抑制M1而促進(jìn)M2基因表達(dá)的關(guān)鍵因素，多孔殼聚糖微球可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2的轉(zhuǎn)化。

圖5. 復(fù)合體系的體內(nèi)植入巨噬細(xì)胞極化指標(biāo)免疫熒光

  最后利用大鼠骨軟骨缺損模型，通過(guò)植入不同組合的水凝膠和多孔微球，優(yōu)化復(fù)合體系的組成，通過(guò)micro-CT、組織染色和評(píng)分對(duì)軟骨和軟骨下骨的再生修復(fù)效果進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，并通過(guò)延長(zhǎng)植入時(shí)間（18w）觀察再生軟骨的穩(wěn)定性和質(zhì)量。通過(guò)Masson染色和破骨Trap染色探索軟骨下骨的修復(fù)模式及其對(duì)再生軟骨穩(wěn)定性的影響，并進(jìn)一步通過(guò)巨噬細(xì)胞極化指標(biāo)的免疫組化對(duì)軟骨缺損原位和關(guān)節(jié)滑膜對(duì)軟骨再生的免疫微環(huán)境進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，以闡明復(fù)合體系通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)促進(jìn)骨軟骨修復(fù)的機(jī)制。

圖6. 不同組合的水凝膠/多孔微球復(fù)合支架植入骨軟骨缺損的示意圖

  相關(guān)研究工作目前以”Injectable immunomodulation-based porous chitosan microspheres/HPCH hydroge composites as a controlled drug delivery system for osteochondral regeneration”為題目發(fā)表在Biomaterials上，論文共同第一作者為廣東省人民醫(yī)院紀(jì)雄發(fā)博士后，華南理工大學(xué)邵宏偉碩士和上海硅酸鹽研究所李曉宏博士后。廣東省人民醫(yī)院張余教授、華中科技大學(xué)楊光教授、武漢大學(xué)蔣序林教授和廣東省人民醫(yī)院紀(jì)雄發(fā)博士后為該文章的共同通訊作者。

  本項(xiàng)目獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32101097），中國(guó)博士后科學(xué)基金（2020M672558）,廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目（A2020020）的支持。

  論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0142961222001703