誘導(dǎo)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞定向分化是組織工程方法實(shí)現(xiàn)對(duì)缺損肌腱組織再生性修復(fù)的一個(gè)關(guān)鍵。目前常用的誘導(dǎo)方法主要包括添加外源生長(zhǎng)因子、使用肌腱脫細(xì)胞外基質(zhì)、施加外源性力學(xué)刺激或?qū)⒏杉?xì)胞與成體腱細(xì)胞共培養(yǎng)等，雖然均具有一定的成腱分化效果，但從分化效率、分化特異性、操作靈活性、價(jià)格成本等方面看，這些單一分化策略都有著各自的局限性。肌腱是在肌肉和骨骼之間傳遞應(yīng)力的重要結(jié)締組織，主要是由平行排列的膠原纖維束和以狹長(zhǎng)形態(tài)嵌入其中的肌腱細(xì)胞組成。電紡取向纖維可從結(jié)構(gòu)上完美地仿生天然肌腱的這種超結(jié)構(gòu)形式，鑒于肌腱組織的力學(xué)活性（mechanoactivity）特點(diǎn)，基于電紡取向纖維發(fā)展可自主施加力學(xué)刺激的力學(xué)活性仿生纖維，將為高效誘導(dǎo)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞分化提供新的思路。
近期，東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院張彥中教授團(tuán)隊(duì)發(fā)展了一種新策略，首先對(duì)聚L-丙交酯-己內(nèi)酯（PLCL）電紡取向纖維進(jìn)行拉伸-固定或循環(huán)回復(fù)后再拉伸-固定的塑形處理，以賦予纖維形狀記憶功能和不同程度的力學(xué)活性，然后利用形狀記憶纖維受限回復(fù)時(shí)產(chǎn)生的應(yīng)力剛化（stress-stiffening）效應(yīng)來(lái)對(duì)人脂肪源干細(xì)胞（ADSCs）提供原位的、動(dòng)態(tài)的力學(xué)刺激（圖1），從而提供了一種基于取向電紡纖維的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與自身力學(xué)刺激的雙重信號(hào)誘導(dǎo)作用，顯著增強(qiáng)了對(duì)ADSCs成肌腱分化的誘導(dǎo)效率。
圖1. 力學(xué)活性纖維制備原理與成腱分化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖：（ⅰ）采用穩(wěn)定射流電紡絲方法制備取向纖維S0，然后利用多次“拉伸-回復(fù)”后再拉伸和固定的方法獲得拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似、靜態(tài)剛度與形狀回復(fù)力不同的力學(xué)活性纖維S1、S4及S8；（ⅰⅰ）采用“動(dòng)態(tài)”變溫條件培養(yǎng)ADSCs，觸發(fā)形狀記憶效應(yīng)（SME）、提供原位力學(xué)刺激及探究細(xì)胞響應(yīng)行為。
研究結(jié)果表明，對(duì)電紡取向纖維的形狀記憶塑形處理影響其拓?fù)湫蚊病⒎肿尤∠蚨群徒Y(jié)晶度變化、靜態(tài)剛度及產(chǎn)生的形狀回復(fù)應(yīng)力大小，具有明顯的應(yīng)力剛化效應(yīng)（圖2）；受熱觸發(fā)形狀回復(fù)的力學(xué)活性纖維不影響細(xì)胞的活力和增殖特性，具有較好的細(xì)胞相容性，但使細(xì)胞的極化特征顯著增強(qiáng)（圖3）；對(duì)與成腱分化相關(guān)的代表性蛋白和基因標(biāo)志物分析表明，力學(xué)活性纖維顯著促進(jìn)ADSCs向肌腱細(xì)胞分化，尤其是具有最大回復(fù)應(yīng)力的S1（+）組（圖4）；力學(xué)活性纖維增強(qiáng)ADSCs的成腱分化與Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)（圖5）。
圖2. 力學(xué)活性纖維的形貌、結(jié)構(gòu)及形狀記憶性能表征：（A）不同力學(xué)活性纖維的掃描電鏡（SEM）形貌觀察；（B，C）不同力學(xué)活性纖維的直徑與取向度分析；（D，E）不同力學(xué)活性纖維的分子鏈取向度與結(jié)晶度分析；（F，G）不同力學(xué)活性纖維在26 oC與40 oC下的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線；（H）不同力學(xué)活性纖維在26 oC與40 oC下的楊氏模量變化比較；（I）不同力學(xué)活性纖維的形狀回復(fù)應(yīng)力與時(shí)間變化關(guān)系；（J）不同力學(xué)活性纖維的儲(chǔ)能模量隨時(shí)間變化關(guān)系比較；（K）剪切波彈性成像技術(shù)觀察不同力學(xué)活性纖維觸發(fā)形狀記憶效應(yīng)后的張力（剛度）變化情況。
圖3. 力學(xué)活性纖維的細(xì)胞相容性檢測(cè)與形貌觀察：（A）不同力學(xué)活性纖維的活/死細(xì)胞染色；（B）不同力學(xué)活性纖維的細(xì)胞增殖；（C）培養(yǎng)3 天后不同力學(xué)活性纖維對(duì)ADSCs形貌的影響（Actin/DAPI染色）；（D）培養(yǎng)3 天后不同力學(xué)活性纖維對(duì)ADSCs形貌的影響（SEM拍攝，細(xì)胞經(jīng)后期上色處理）；（E）基于C圖結(jié)果對(duì)ADSCs細(xì)胞形貌進(jìn)行的量化分析。
圖4. 力學(xué)活性纖維促進(jìn)ADSCs向肌腱細(xì)胞定向分化：（A，B）培養(yǎng)7天后對(duì)成腱標(biāo)志物TNMD與TNC的免疫熒光染色結(jié)果；（C，D）TNMD與TNC的熒光強(qiáng)度定量結(jié)果；（E）培養(yǎng)7天后ADSCs成肌腱分化的RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果。
圖5. 力學(xué)活性纖維增強(qiáng)ADSCs成腱分化與Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)的機(jī)理驗(yàn)證：（A）對(duì)S1（+）組進(jìn)行抑制劑處理后的細(xì)胞骨架染色結(jié)果比較；（B）對(duì)抑制劑處理后的細(xì)胞形貌特征的量化分析結(jié)果；（C）抑制劑處理對(duì)與肌腱相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果的影響；（D）S1（+/-）及Y27632-S1（+）組YAP免疫熒光染色；（E）YAP熒光染色核定位定量分析；（F）力學(xué)活性纖維促進(jìn)ADSCs成肌腱分化的潛在作用機(jī)理示意圖。
該研究發(fā)展的這種可自主施加力學(xué)刺激的力學(xué)活性纖維為研究干細(xì)胞的成腱分化提供了一種新的力學(xué)加載范式，也證明了該研究采用的“拓?fù)湫盘?hào)+力學(xué)信號(hào)”組合式信號(hào)誘導(dǎo)策略的有效性。這將為未來(lái)設(shè)計(jì)更先進(jìn)的力學(xué)活性組織工程支架提供借鑒，促進(jìn)原位力學(xué)信號(hào)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化策略向臨床應(yīng)用的實(shí)際轉(zhuǎn)化，提高對(duì)受損肌骼系統(tǒng)的再生修復(fù)功效。
以上研究工作以“Engineering a Mechanoactive Fibrous Substrate with Enhanced Efficiency in Regulating Stem Cell Tenodifferentiation”為題最近在線發(fā)表在ACS Applied Materials & Interfaces上。東華大學(xué)博士生郭煦然、王先流分別為論文的第一作者和共同第一作者，張彥中教授為通訊作者。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目和上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目的經(jīng)費(fèi)支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acsami.2c04294
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