免疫治療已發展成為繼手術、放療和化療之后的第四大腫瘤治療手段。其中，基于T細胞的過繼性細胞免疫療法（ACT）是一大熱點研究方向，其策略是體外分離、修飾改造和擴增患者的T細胞后回輸患者體內，以激發自身免疫系統產生對腫瘤的殺傷能力。目前，這種手段已在部分實體瘤治療中表現出良好的效果。然而，在治療及療效評價過程中，如何對T細胞及其活力進行實時監測示蹤仍是亟待解決的重要技術難題。
鈣離子（Ca2+）作為細胞內的第二信使，與細胞增殖死亡、組織器官發育中的許多生化反應過程密切相關。在T細胞中，鈣離子同樣有著關鍵的調節作用，其濃度水平可以反映T細胞的激活狀態。基于這一原理，東華大學史向陽教授團隊設計構建了一種可用于T細胞CT和熒光雙模態成像的樹狀大分子包裹納米金顆粒探針（{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs），實現T細胞及其活力監測和示蹤。課題組以第五代聚酰胺胺（PAMAM）樹狀大分子為平臺，在其內部包裹納米金顆粒用于CT成像，外圍通過酯鍵共價修飾鈣信號傳感分子Fluo-4用于熒光成像（圖1）。Fluo-4具有很高的鈣離子親和力，當它以游離形式存在時幾乎無熒光，但與細胞內鈣離子結合后則會激發出較強的綠色熒光，從而可以直觀地反映T細胞內鈣離子的水平及T細胞的激活狀態。
圖 1. 納米探針 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs的合成示意圖。
研究團隊通過核磁共振氫譜、紫外吸收光譜和熒光發射光譜等手段對獲得的探針材料進行表征，結果均顯示Fluo-4可成功修飾于樹狀大分子表面（圖2）。探針的細胞相容性良好，在濃度達到5 μM時，仍能保證T細胞維持90 %以上細胞活力。同時探針也具有較高的T細胞攝取效率，探針對T細胞的標記效率高達84.6%。
圖 2. （a）未連接Fluo-4的對照組 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14 DENPs（綠）、探針 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs（紅）、游離態Fluo-4（藍）、商用鈣熒光探針Fluo-4, AM（紫）的紫外吸收光譜圖；（b）游離態Fluo-4（綠）、商用鈣熒光探針Fluo-4, AM（紅）、探針{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs（藍）在Ca-EGTA高鈣緩沖溶液中的熒光發射光譜圖。
為了驗證納米探針對T細胞的活力探測，研究團隊利用聯合激活劑PMA/Iono活化T細胞，首先通過測試T細胞分泌的細胞因子γ-干擾素和白介素-2確認T細胞的激活。進而采用探針對不同活化時間后的T細胞進行檢測，結果表明修飾了Fluo-4的樹狀大分子納米探針在被T細胞攝取后，探針上連接的Fluo-4分子能夠被胞內酯酶剪切而游離出來，與鈣離子結合并產生熒光，顯示出和商用鈣熒光探針Fluo-4, AM相近的胞內熒光成像效果。同時，隨著活化時間的延長，胞內鈣離子濃度上升，熒光強度也隨之提升，顯示出探針具有動態監測T細胞激活狀態的潛力（圖3）。
圖3. PBS、探針 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs、商用鈣熒光探針Fluo-4, AM與被PMA/Iono活化0、4、18小時的T細胞共孵育4小時后的熒光檢測結果。（a）激光共聚焦顯微鏡熒光圖；（b）流式細胞術熒光強度檢測結果；（c）流式細胞術熒光強度結果分析直方圖。
隨后，課題組將標記了納米探針的激活的T細胞注射在小鼠皮下，進而通過CT和活體熒光顯像監測T細胞的定位。研究發現，注射五分鐘后，注射部位即能發現明顯增強的CT信號，同時熒光強度也有所增加（圖4）。兩種成像結果互相印證，顯示所合成的納米探針在標記T 細胞后能夠實現其在小鼠體內的CT/熒光雙模態成像示蹤。
圖 4. PMA/Iono活化18小時的T細胞標記探針 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs后，在小鼠背部皮下注射后的T細胞成像示蹤結果。（a）CT成像結果圖；（b）注射前后CT信號值；（c）小動物熒光成像結果圖；（d）注射前后相對熒光強度。
以上研究以“Multifunctional Dendrimer-Entrapped Gold Nanoparticles for Labeling and Tracking T Cells Via Dual-Modal Computed Tomography and Fluorescence Imaging”為題，發表在美國化學會期刊Biomacromolecules (DOI: 10.1021/acs.biomac.0c00147)上。第一作者為東華大學化學化工與生物工程學院的碩士研究生陳玫秀，東華大學的史向陽教授和以色列巴伊蘭大學的Rachela Popovtzer教授為共同通訊作者。該工作得到了國家重點研發計劃政府間國際科技創新合作重點專項項目、國家自然基金委、上海市科委等項目的資助。
論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00147
