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  因先天性薄弱、外傷、腫瘤術后導致的腹壁缺損是近年來常見的外科臨床問題。腹壁缺損可能導致疝氣的發(fā)生，致使腸梗阻甚至于腸壞死，進而危及生命。目前，外科手術為治療腹壁缺損的金標準，但傳統(tǒng)的直接縫合方法因極高的復發(fā)率被無張力補片修補術而替代。普外科醫(yī)生通常使用永久性聚合物網片[如聚丙烯網片(PP)]來加固缺損區(qū)域。然而，這種網片會誘發(fā)明顯的異物反應并導致組織纖維化，可能會導致慢性疼痛并在術后進一步限制患者正常運動。此外，傳統(tǒng)補片不具有粘附性，需要絲線固定，延長了手術操作時間，加大暴露風險。由于修補材料不可吸收，會導致一系列并發(fā)癥，包括腸糜爛和患者體力活動受限等。此外，使用生物補片如豬小腸粘膜和真皮是修復腹壁缺損的替代策略。但是，生物補片的應用仍然受到其過程復雜、強度低和成本高的限制。因此，亟需開發(fā)一種使用方便、微創(chuàng)治療、仿生、濕態(tài)下高粘附、良好機械性能、抗菌和促進組織修復的生物多功能補片用于腹壁缺損修復。

  針對上述臨床問題和需求，青島大學轉化醫(yī)學研究院周祺惠特聘教授團隊/附屬醫(yī)院普外科盧云主任團隊基于席夫堿反應開發(fā)了一種生物多功能羧甲基殼聚糖（CMCS）和四臂聚（乙二醇）醛（4-arm-PEG-CHO）水凝膠補片用于全層腹壁缺損修復。所設計和制備的水凝膠表現出優(yōu)異的自愈性和機械性能，在濕態(tài)下具有高粘附力，以及顯著的抗菌能力。另外，體外細胞實驗表明，所制備的水凝膠加載重組牛堿性成纖維細胞生長因子（rb-bFGF）后可以顯著促進細胞增殖和遷移，進而加快了大鼠模型中全層腹壁缺損修復。組織形態(tài)學實驗表明，與臨床常用的商品化PP補片相比，所開發(fā)的水凝膠補片能夠通過上調 Ki67的產生促進腹壁組織的修復和增厚，誘導膠原蛋白和新生血管形成，同時可以通過減少IL-6、TNF-α和IL-1β的表達來抑制炎癥。這些結果表明，這種新型生物多功能水凝膠補片在治療全層腹壁缺損方面具有巨大潛力。

圖1. 生物多功能水凝膠補片的制備及其在全層腹壁缺損修復中的應用。

  如圖2（A）所示，¹H核磁光譜結果表明存在醛基(10.04 ppm)、苯環(huán)(8.14–8.16、7.88–7.90 ppm)和酯基(4.45 ppm) 質子的峰，表明成功合成出4-arm-PEG-CHO。如圖2（B）的紅外光譜結果所示，4-arm-PEG-CHO 中1703和1723 cm^-1處的峰歸屬于–C=O ，這進一步表明–CHO 的成功引入。水凝膠中1713 cm^-1處的峰證實了CMCS的氨基與4-arm-PEG-CHO的醛基之間發(fā)生席夫堿。為了研究不同組分比例的水凝膠的成膠特性，他們配置了三種不同比例的水凝膠(4-arm-PEG-CHO/CMCS重量比為 4:1、2:1 和 8:7，分別對應命名為凝膠1、2和3)。由于外科醫(yī)生在手術過程中需要時間來微調補片覆蓋的區(qū)域，所以3–5分鐘是最適合的成膠時間。如圖2（C）/（D） 所示，不同組分比例的水凝膠室溫下成膠時間滿足上述要求。

圖2. (A) 4-arm-PEG-CHO的¹H核磁光譜圖。(B) CMCS、4-arm-PEG-CHO和水凝膠的紅外光譜圖。(C) CMCS 溶液、用紅色顏料染色的4-arm-PEG-CHO溶液和所形成的水凝膠照片。(D) 凝膠1、2和3的成膠時間。

  用于腹壁缺損修復的水凝膠應具有較強的濕態(tài)下組織粘附力，能夠長時間黏附于腹壁上并承受腹內壓力。如圖3所示，凝膠1、2和3的平均爆裂壓力分別為217.5、150.0和90.0 mmHg，顯著高于正常腹內壓（5 mmHg），甚至高于IV級腹腔筋膜室綜合癥的壓力（25 mmHg）。水凝膠1和2還可以滿足因咳嗽、打噴嚏等引起的腹內壓快速升高這一情況的要求。另外，在模擬體內生理環(huán)境下，6天后水凝膠對濕潤皮膚仍表現出良好的粘附性能，可以有效防止水凝膠在手術后移位。體外剪切黏附試驗可以檢測腹壁缺損修復術后因粘附性不足引起補片脫落。在體外搭接剪切試驗中，如圖 3（D） 所示，水凝膠2緊密粘附在兩片豬皮上，并能承受了200 g的負荷。

圖3. (A) 凝膠1–3的平均爆破壓力。(B) 爆破壓力測試示意圖。(C) 剪切黏附試驗示意圖。(D) 凝膠2在豬皮上的剪切黏附力（重量 = 200 克）的照片。(E) 凝膠 1–3 的平均剪切黏附力。

  為了評估水凝膠的自愈能力，他們分別進行了宏觀自愈觀察和流變自愈測試。如圖4（A）所示，沒有任何外部刺激的情況下，被切割后的水凝膠再次愈合成完整的蝴蝶形水凝膠，并且自愈合后的水凝膠強度足以支撐自身重量。為了進一步評估水凝膠的自修復特性，基于10 rad/s的角頻率進行流變恢復測試。當應力加大到（γ=200%）時水凝膠的G''從37 kPa急降到3.7 kPa，并且G" > G''，表明水凝膠網絡已被破壞，應力恢復到初始狀態(tài)后，G''和G"立即恢復了原始值。經過多次循環(huán)后，G''沒有顯著下降（圖 4（C））。這種水凝膠的自愈作用主要取決于水凝膠中動態(tài)官能團之間的動態(tài)反應。在臨床上的應用意義為：如果患者術后切口受損，補片發(fā)生破裂，水凝膠可自愈合，有效防止復發(fā)。

圖4. (A) 蝴蝶形水凝膠宏觀自愈的照片。(B) 應變幅度掃描(γ=1–1000%)在固定角頻率(10 rad/s)下水凝膠2的G'' 和 G"。(C) 以 1 和 200% 的應力下進行流變恢復測試。

  一般來說，無張力腹壁缺損修補手術會存在不可避免的感染風險，因此水凝膠補片除了作為物理屏障外，還應具有一定的抗菌特性。在體外抗菌測定中，采用菌落法（CFU）來研究水凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。圖5（A）顯示所有水凝膠均對兩種細菌顯示出一定的抗菌作用。為了更好地了解不同樣品的抗菌活性，通過細菌菌落數來計算抑菌率。如圖5（B）/（C）所示，隨著水凝膠中CMCS比例的增加，抗菌活性增強。可能由于CMCS同帶負電荷的細菌表面結合，擾亂細胞膜，細胞內成分泄漏而導致細菌死亡。此外，動態(tài)希夫堿在水凝膠中起著重要的抗菌作用。總體而言，這種水凝膠具有一定的抗菌活性，用作腹壁缺損補片時可以減少細菌感染的發(fā)生。另外，具有止血功能的水凝膠可以減少手術中電凝的使用，有利于組織修復和新生血管的形成。為了證實水凝膠的止血效果，他們以使用肝素化的小鼠全血為模型，測量了水凝膠的血液凝固效果。當分別與4-arm-PEG-CHO和CMCS混合后，血液沒有凝固。而當全血與水凝膠混合時，水凝膠可以有效地封閉血液，在PBS中浸沒30分鐘后，水凝膠中仍然沒有血性物質滲出。血液的凝膠化主要歸因于苯甲醛和氨基之間的席夫堿反應，以及水凝膠的溶脹作用。

圖5. (A) 與水凝膠共培養(yǎng)后瓊脂板上存活細菌菌落的照片。(B, C) 水凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率。(D) 水凝膠的止血效果圖片。

  為了加速組織修復，rb-bFGF被引入到水凝膠中。他們分別將添加和未添加rb-bFGF 的水凝膠與人成纖維細胞進行共培養(yǎng)。如圖6（A）所示，所有樣品中的人成纖維細胞具有典型的紡錘形貌以及相似的細胞數量。此外，他們還進行了活死細胞染色以評估水凝膠的細胞毒性（圖 6（B）/（C））。結果表明，水凝膠與人成纖維細胞共培養(yǎng)1天后，各組細胞存活率均大于99%，所有組之間沒有顯著差異。如圖6（D）所示，第 1、3和5天的 CCK-8 檢測結果顯示，與對照組相比，添加rb-bFGF的水凝膠組在第三天時細胞數量顯著增加，并在第5天仍保持增加的趨勢。所有這些結果表明，該水凝膠作為腹壁缺損補片具有優(yōu)異的細胞相容性。細胞劃痕試驗被用來研究水凝膠對細胞遷移的影響 (圖6（E）)。細胞被孵育 24 小時后，凝膠2+rb-bFGF組實現了最快的劃痕閉合（細胞覆蓋面積的 89.5%）。凝膠1–3和對照組之間沒有顯著差異。綜上所述，凝膠2 + rb-bFGF 樣品顯著促進細胞增殖和遷移，顯示出對腹壁缺損修復的巨大潛力。

圖 6. (A) 人成纖維細胞與水凝膠1–3共培養(yǎng) 24 小時的熒光圖像。紅色表示通過 TRITC-鬼筆環(huán)肽染色的肌動蛋白，藍色表示通過DAPI染色的細胞核。(B, C) 人成纖維細胞與水凝膠共培養(yǎng) 24 小時后的活/死染色熒光圖像和定量分析。紅色熒光代表死細胞，綠色代表活細胞。(D) 水凝膠與成纖維細胞孵育 1、3 和 5 天后的細胞增殖情況。(E) 劃痕處理后0、2、6、12和24小時各組細胞覆蓋占比。

  大鼠腹壁缺損修復實驗被用來評估水凝膠在體內條件下的腹壁修補能力。如圖7（A）所示，術后14、30和120 天，添加了rb-bFGF的凝膠2組和陽性對照組（PP網）均未觀察到動物死亡或疝氣發(fā)生。14天時，在水凝膠補片組觀察到纖維結締組織生長、新生血管形成和腹壁組織邊界消失。30天時，原有腹部缺損處充滿纖維結締組織，組織內可見新生血管。120天時，再生組織的厚度與正常腹壁的厚度幾乎相同。在 PP 網片組中，各個時間段均存在有不同程度的炎癥反應，同時腹壁和皮膚之間有大量的組織粘連。此外，與PP補片組相比，水凝膠組在手術過程中無需進一步固定，大大縮短了手術時間，避免了絲固定所造成的組織損傷。

  如圖 7 （C）/（D） ，手術部位的組織病理學檢查顯示出水凝膠組有良好的組織相容性、無明顯炎癥反應和促進血管生成的能力。PP組周圍組織的炎癥在實驗過程中持續(xù)存在。炎癥細胞主要聚集在PP細絲表面，存在慢性炎癥。新生血管的形成是評價修復效果的重要指標，如圖 8（B） 所示，在第14、30和120天，水凝膠組的血管數量明顯高于PP組。Masson染色膠原沉積（圖7（E）/（F））實驗結果顯示，與PP組相比，水凝膠修復的腹壁缺損處形成了更多膠原蛋白。

圖 7. (A) 大鼠全層腹壁缺損模型示意圖。(B) 在第 0、14、30 和 120 天用添加 rb-bFGF 的水凝膠 2 和 PP補片處理后的腹壁組織照片。(C) 在第 14、30和120天，PP和Gel 2+rb-bFGF組的H&E 染色分析。紅色箭頭表示新生血管。(D) 第 14、30 和 120 天新生血管的定量分析。(E) 第 14、30 和 120 天腹壁缺損的 Masson染色圖像。藍色區(qū)域表示腹壁缺損處新沉積的膠原纖維。(F) 膠原形成的定量分析。

  最后，通過免疫組織化學染色檢測IL-6、IL-1β 和 TNF-α等在慢性炎癥、自身免疫和傳染病中發(fā)揮重要作用的炎癥因子以評估腹壁缺損修復中的炎癥反應（圖 8（A）/（B））。結果顯示，PP組IL-6、IL-1β和TNF-α陽性細胞密度明顯高于Gel 2+rb-bFGF組，進一步證實了水凝膠組的抗炎活性。此外，如圖 8（C）/（D）所示，在第 14 天，使用添加 rb-bFGF 的 Gel 2補片治療的腹壁缺損處Ki67表達量明顯高于PP組。第30天和第120天兩組Ki67表達無顯著差異，這一結果可能是由于加載rb-bFGF的水凝膠在早期已釋放完全。綜上所述，與傳統(tǒng)的PP補片相比，加載生長因子的水凝膠補片可以通過下調IL-6、IL-1β和TNF-α的表達來減少慢性炎癥的發(fā)生。早期通過對rb-bFGF的緩慢釋放，增加Ki67的表達，進而顯著促進細胞增殖。

圖 8. (A, B) IL-6 和 (C, D) Ki67 在第 14、30和120天的免疫組織化學染色和定量數據。

  以上相關工作以“Bio-Multifunctional Hydrogel Patches for Repairing Full-Thickness Abdominal Wall Defect”為題，發(fā)表在《Advanced Functional Materials》雜志上(DOI: 10.1002/adfm.202105614)。本文第一作者為青島大學碩士研究生尹祥意和共同第一作者為博士后郝源萍，通訊作者為青島大學轉化醫(yī)學院周祺惠特聘教授和附屬醫(yī)院胃腸外科副主任醫(yī)師胡繼霖。

  該工作得到了國家自然科學基金（No. 31900957），山東省自然科學基金（No. ZR2019QC007）和山東省高等學校青創(chuàng)科技計劃（No. 2019KJE015）的支持。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202105614

  另外，周祺惠特聘教授在“（干）細胞與生物材料界面相互作用”和“新型生物醫(yī)用材料的設計、制備及其在生物醫(yī)學方面應用”等方面發(fā)表研究論文多篇：(1) Chemical Reviews 2021, 121: 4561；(2) Science Advances 2020, 6: eaay2756；(3) Journal of Nanobiotechnology 2021, 19:216；(4) ACS Applied Materials & Interfaces 2021, 13: 17289; (5) Carbohydrate Polymers 2021, 10.1016/j.carbpol.2021.118493; (6) Materials & Design 2020, 193: 108863; (7) International Journal of Biological Macromolecules 2021, 180: 599等。更多信息詳見周祺惠特聘教授課題組網站：https://www.x-mol.com/groups/BMTMers，課題組微信公眾號：“生物材料與轉化醫(yī)學課題組”。