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  先天性缺陷、外傷、腫瘤、原發性肌病、代謝性疾病等各種原因造成的骨骼肌缺損和功能喪失是臨床常見的病例。傳統治療方法主要是肌皮瓣移植，但由于可利用的自體肌肉來源有限，對供區損傷較大給病人帶來新傷害；而異體移植供體同樣面臨來源有限，且存在免疫排斥等問題，使其應用受到限制。組織工程方法是將體外培養和擴增的高濃度功能相關組織細胞種植在一種生物相容性好、同時能夠被機體降解的生物材料上，即組織工程支架材料，形成材料-細胞復合物，將此復合物移植到所需部位，在機體內細胞繼續增殖，而支架材料逐漸被降解、吸收，從而達到修復受損組織或重建功能的目的。基于組織工程方法體外構建血管化肌肉微組織，有望解決骨骼肌組織缺損和功能喪失等問題。

  華僑大學陳愛政教授課題組和哈佛醫學院Y. Shrike Zhang教授課題組基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）多孔微球及聚乙二醇（PEG）中空短棒狀微纖維，分別通過成肌細胞（C2C12）與人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的負載成功構建血管化肌肉微組織，并通過共同注射的方式研究該肌肉微組織在血管化肌組織原位方面的應用（圖1）。

圖1. 研究示意圖。

  首先，利用微流控技術制備了PLGA大多孔微球（PLGA PMs）并體外構建微組織（圖2）。通過微流控技術制備的PLGA PMs平均粒徑為395 μm，擁有開放且相互貫通的孔洞，孔徑為10-60 μm。在PLGA PMs中接種C2C12，通過動態培養法探索細胞組織聚集體的形成條件及肌肉微組織的形成過程，構建3D肌肉微組織模型。結果發現，在共培養7天后，分散性良好的微球之間開始聚集，并在后續培養過程中形成組織團塊。

圖2. 基于PLGA PMs體外構建肌肉微組織

  然后，通過微流控技術和光聚合技術相結合得到負載HUVECs的中空短棒狀血管微組織。以丙烯酸-聚乙二醇-琥珀酰亞胺基羧甲基酯（Acr-PEG-NHS）為原料，以共價修飾的方法得到了細胞活性好的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-PEG-Acr（RGD-PEG-Acr）及血管內皮生長因子-PEG-Acr（VEGF-PEG-Acr），并研究了修飾作用下材料的生物安全性及對HUVECs生長的調控作用。另外，采用復乳法制備載堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的PLGA納米粒（NPs），并復合到PEG水凝膠網絡中（圖3）。利用微流控技術和UV引發光聚合技術制備了中空短棒狀微纖維，微纖維外徑約為350 μm、內徑約為110 μm、厚度約為120 μm、長度約為1.5 mm，DAPI染色結果表明體外培養5天后，支架仍具有良好的中空結構及機械強度，HUVECs呈管狀分布；且實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）方法分析結果顯示促血管生成素（Ang-2）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和酪氨酸激酶-2（Tie-2）中特定信號傳導部分的表達水平均有顯著性提升，表明了體外血管形成的趨勢。

圖3. 基于PEG HMs體外構建血管微組織

  接著，為了進一步研究共混后的肌肉微組織及血管微組織在體內的作用情況，在已經形成的肌缺損部位注射入混合肌肉微組織、血管微組織作為實驗組，同時分別注射生理鹽水、乙醇、空白支架、混合細胞懸液為對照組，以造模后不處理作為空白對照組，觀察SCID大體積肌缺損的肌肉修復和組織再生情況（圖4）。通過HE染色觀察注射后組織的水腫、纖維化、及肌細胞再生的情況。根據HE結果分析可以看出術后3 d內屬肌組織的破壞、炎癥階段，3 d - 14 d為肌組織修復階段，注射入機體的PLGA PMs由于含有大量成熟的C2C12細胞，且體外實驗證明，在動態培養下C2C12-PLGA PMs能夠出現自由聚集，這些聚集有助于微載體中的C2C12根據機體需要和自身的成肌細胞組裝形成中心排列的核進而形成肌纖維。14 d - 28 d為肌組織重塑階段，對于實驗組來說，成纖維細胞的增生為合成結締組織、為再生組織提供穩定的微環境起到重要作用，肌組織的修復基本完成。

圖4. SCID右后腿脛前肌注射、肌肉微組織+血管微組織、乙醇、空白支架、生理鹽水、細胞混懸液及空白對照組不同時間后HE染色分析

  通過Masson染色觀察細胞在組織內部的作用及肌肉的損傷、炎癥的修復及纖維化情況（圖5）。Masson染色觀察細胞在組織內部的作用及肌肉的損傷、炎癥的修復及纖維化情況結果和HE染色結果大體一致，成纖維細胞的大量增殖過程導致了膠原纖維的產生，實驗組在術后28 d時呈現出形狀規則、紅色均勻分布的肌組織形態，其它對照組均出現了不同程度的膠原纖維的過度再生和沉積，最終導致了瘢痕的形成，影響了骨骼肌組織功能的重建。

圖5. SCID右后腿脛前肌注射肌肉微組織+血管微組織、乙醇、空白支架、生理鹽水、細胞混懸液及空白對照組不同時間后的Masson染色分析

  最后，利用免疫熒光組織學染色觀察組織內部不同組別血管生成相關因子CD31、VE-Cad的表達情況及肌纖維形成相關蛋白Desmin、MyoD的表達情況。研究結果表明，基于微流體控技術制備的大多孔高分子微球、中空短棒裝微纖維作為微載體在構建血管化組織用于組織再生的研究具有潛在的應用前景。

  以上相關成果以“Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration”為題，近期在線發表于《Biomaterials》。論文通訊作者為華僑大學陳愛政教授和哈佛醫學院Y. Shrike Zhang教授，論文第一作者為華僑大學化學工程與技術2020屆博士畢業生王穎。華僑大學王士斌教授、Ranjith Kumar Kankala副教授、張建庭講師、2020屆博士畢業唐含笑、2020屆碩士畢業蔡園園、復旦大學中山醫院朱鎧副教授和福建醫科大學楊達云副教授為論文的共同作者。

  華僑大學部分的研究工作得到國家自然科學基金（81971734，32071323）、國家自然科學基金海峽聯合重點項目（U1605225）以及福建省生物材料科技創新團隊項目的資助。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121072

作者簡介：

陳愛政：博士、教授、博士生導師。

福建省優秀教師，入選國家百千萬人才工程、被授予“有突出貢獻中青年專家”榮譽稱號。目前擔任中國生物材料學會理事、中國生物材料學會復合材料分會秘書長、中國生物材料學會青年委員會委員、華僑大學生物材料與組織工程研究所所長、福建省生物材料科技創新團隊帶頭人、福建省生物材料化工博士生導師團隊帶頭人。主持國家自然科學基金海峽聯合重點項目、面上項目、國家重點研發計劃政府間國際科技創新合作重點專項等國家級課題8項。主要從事超臨界流體技術及生物材料與組織工程領域的研究，已在AM、AFM、Small、JCR、CEJ、AHM、Biomaterials、Biofabrication等期刊發表SCI收錄論文100余篇，獲授權國家發明專利10余項。

課題組網頁：https://www.x-mol.com/groups/hqubiomat 

Y. Shrike Zhang：博士，美國哈佛大學醫學院助理教授，2013年于Georgia Institute of Technology生物醫學工程系取得博士學位。研究領域包括生物打印及器官芯片的平臺搭建與應用研究，在相關領域發表研究論文及綜述240余篇，包括以第一或通訊作者發表的PNAS、Science、Nat. Rev. Mater.、Nat. Rev. Nephrol.、Nat. Commun.、Matter、Adv. Mater.、ACS Nano、Angew. Chem. Int. Ed.、Biomaterials 等，其中超過45篇封面文章；研究成果曾被BBC、Fox News、The Boston Globe/STAT News、Science Daily、Technology Networks、IEEE Spectrum、C&EN、《科技日報》等報道。擔任20余本雜志的主編、副主編或編委，曾獲得多種國際和地區性獎項40余項。

課題組網頁：https://shrikezhang.com/