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  近年來，耐藥細菌的持續和快速出現與傳播對新型抗菌藥物研究提出了迫切需求。宿主防御肽因其廣譜抗菌活性且不易產生耐藥性的優點而被作為有前景的抗耐藥菌感染藥物研究新思路被寄予厚望。然宿主防御肽的應用受到易被蛋白酶水解、體內穩定性差、制備成本高等缺點的限制。因此，研究耐蛋白酶水解、合成方便且具有高效抗耐藥菌感染能力的宿主防御肽模擬物具有重要意義。

  近日，劉潤輝教授課題組報道了一種對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等多種耐藥革蘭氏陽性菌具有高效抗菌活性和抗感染治療潛力的類肽聚合物。該研究成果以“Addressing MRSA Infection and Antibacterial Resistance with Peptoid Polymers”為題發表在Nature Communications上（Nat. Commun. 2021, 12, 5898）。

  作者通過α-NNCA的一鍋法開環聚合方便地制備具有不同C-端官能團的抗菌類肽聚合物R-(Naeg)_n。優選類肽分子HS(Naeg)₂₀對 MRSA 等多種耐藥陽性菌具有高效抗菌活性，對MRSA休眠細菌和對抗生素高度耐藥的MRSA生物膜同樣有效，并且使用優選分子HS(Naeg)₂₀連續刺激細菌834代未產生耐藥性；在小鼠全皮層感染模型、角膜炎模型和腹膜炎模型中，HS(Naeg)₂₀顯示出與最后一線抗生素萬古霉素相當的體內抗MRSA感染效果。

圖1. 設計并合成具有抗MRSA活性的類肽聚合物

  作者研究了不同端基類肽聚合物對多種革蘭氏陽性菌的體外抗菌活性，所有聚合物均展現出有效抗菌活性，其中硫醇封端的類肽活性最好。進一步合成了不同鏈長的硫醇封端類肽分子HS(Naeg)_n，發現類肽分子對S.aureus ATCC6538的抗菌活性具有鏈長依賴性，其中20和40 mer鏈長類肽分子的抗菌活性更優。最終，通過對比研究兩種鏈長聚合物對哺乳動物細胞的毒性，發現HS(Naeg)₂₀具有更低的溶血和細胞毒性以及更高的選擇性。進一步研究表明，HS(Naeg)₂₀對其他耐藥甚至多重耐藥的臨床分離菌株都具有高抗菌活性，并且在模擬生理環境的血清或鹽的存在下，HS(Naeg)₂₀的活性幾乎保持不變。

圖2.類肽聚合物具有優異的體外抗菌性能

  為研究類肽聚合物的抗菌機理，作者進行細菌質膜去極化實驗，發現HS(Naeg)₂₀對金黃色葡萄球菌僅顯示出較弱的膜去極化作用。使用熒光分子標記的聚合物Dye(Naeg)₂₀通過熒光共聚焦顯微鏡觀察其殺菌過程發現，Dye(Naeg)₂₀并未在細菌膜表面富集，而是直接穿過細胞膜進入細胞內部，在細胞質中富集約300 s后，PI進入細菌內部表明細菌膜受損。進一步研究發現，HS(Naeg)₂₀與DNA之間有強烈的相互作用，且細菌與聚合物共孵育后ROS水平在30 min內提高了5.5倍。而通過添加抗氧化劑猝滅大量生成的ROS使其降低至細菌正常水平后，HS(Naeg)₂₀的抗菌活性明顯降低。綜上，作者推測HS(Naeg)₂₀可能通過與產生高水平ROS和DNA 結合相關的復雜機制來殺菌。高水平ROS可以通過破壞細菌膜來殺死細菌，SEM和TEM表征結果顯示HS(Naeg)₂₀處理的金葡菌細胞膜的明顯受損且細菌內容物明顯減少。

圖3.類肽聚合物的抗菌機理

  通過產生過量ROS和DNA結合等多重作用機制， HS(Naeg)₂₀與傳統抗生素相比，在治療抗生素耐藥細菌以及生物膜感染和解決細菌耐藥性方面顯示突出優點：1）連續使用HS(Naeg)₂₀刺激細菌834代，細菌沒有產生耐藥性，而對于抗生素刺激的細菌很快獲得高達1024倍的耐藥性；2）與抗生素相比，HS(Naeg)₂₀具有更快的殺菌動力學；3）HS(Naeg)₂₀對MRSA休眠細菌同樣具有滅殺能力，而抗生素則無效；4）HS(Naeg)₂₀能夠抑制MRSA生物膜形成，并且有效根除抗生素高度耐藥的生物膜。

圖4. 類肽聚合物具有不易產生耐藥性、快速細菌滅殺、根除休眠細菌和生物膜的能力

  作者評估了HS(Naeg)₂₀在小鼠體內抗耐藥菌感染的效果。在小鼠全皮層傷口感染模型中，作者使用了MRSA、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌三種耐藥陽性菌，結果表明，HS(Naeg)₂₀均顯示出相當甚至優于最后一線抗生素萬古霉素的體內殺菌活性。此外，在MRSA角膜炎傷口感染模型中，HS(Naeg)₂₀治療后小鼠眼睛的細菌明顯減少，而萬古霉素則無效。

圖5. 類肽聚合物在小鼠全皮層傷口模型和角膜炎模型中顯示出體內抗菌功效

  作者進一步使用腹膜炎模型評估了類肽分子對小鼠全身性感染的治療效果。實驗結果表明，在MRSA、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌三種耐藥陽性菌感染的腹膜炎模型中， 通過HS(Naeg)₂₀腹腔單劑量治療均能大幅度提高感染小鼠的存活率，小鼠主要器官、血液和腹腔液中的細菌負荷分析發現，HS(Naeg)₂₀殺菌效果與萬古霉素相當。體內毒性研究表明，HS(Naeg)₂₀給藥后小鼠肝臟和腎臟的臨床重要生物標志物沒有明顯差異，在組織學分析中也沒有觀察到明顯的組織損傷。綜上，在多種耐藥陽性菌感染的多種動物模型中HS(Naeg)₂₀均顯示出有效的體內抗感染效果。

圖6. 類肽聚合物在小鼠腹膜炎模型中顯示出體內抗菌功效同時沒有明顯體內毒性

  盡管類肽已被作為宿主防御肽抗菌模擬物來探索，用以應對抗生素耐藥性細菌感染的巨大挑戰。然而，固相合成成本高、耗時長且難以大規模合成的缺點，阻礙了類肽的發展應用。作者通過α-NNCA一鍋法開環聚合制備的抗菌類肽聚合物，具有低成本、容易大規模合成、結構多樣性等優點。重要的是，優選類肽分子在多種動物模型中均展示出高效的體內抗感染效果，結合其不易產生耐藥性等諸多優點，使其在抗耐藥微生物感染領域具有廣泛的應用前景。

  華東理工大學博士研究生謝佳洋和周敏博士是該論文的第一作者，華東理工大學劉潤輝教授是通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金委、科技部等基金的資助。

  論文鏈接: https://www.nature.com/articles/s41467-021-26221-y