傳統的小分子藥物化療存在水溶性和生物利用度低、治療效果差、對正常組織致死率高、易被網狀內皮系統清除等問題。為了完成藥物對腫瘤的靶向遞送，人們構建了多種納米平臺，賦予化療藥物特異性靶向能力和延長的血液循環時間。近年來，新一代納米平臺的設計重點是“一體化”策略，即一種整合癌癥治療學的診斷和治療元素的策略。然而，構建簡單和具有生物相容性成分的“一體化”納米平臺以促進多模式腫瘤治療仍然是一個巨大的挑戰。
最近的研究表明，通過多酚和金屬離子的配位形成的金屬-酚類網絡可將化療藥物負載在其疏水腔中。例如，具有優異生物安全性和生物相容性的天然植物多酚單寧酸（TA），它易于螯合Fe3+形成穩定且對pH較敏感的TA-Fe（TAF）納米復合物，可用于在酸性腫瘤微環境（TME）中化療藥物的pH響應性釋放。更重要的是，TAF納米復合物中的Fe3+可用于化學動力學治療（CDT），從而誘導癌細胞的鐵死亡（一種新興的程序性細胞死亡形式）。簡而言之，TAF在TME中解離后，TA可以將Fe3+轉化為Fe2+，然后Fe2+可與癌細胞中過表達的過氧化氫（H2O2）觸發Fenton反應，生成細胞毒性羥基自由基（?OH），并進一步消耗細胞內的谷胱甘肽（GSH）增強誘導癌細胞死亡。通過這種方式，載有化療藥物的TAF納米復合物可以實現CDT和化療的聯合。此外，在TME下TAF納米復合物解離的鐵離子具有r1弛豫率，從而實現T1加權的MR成像。
對于納米平臺中的靶向輸送系統，已有研究人員通過化學偶聯等方法用各種靶向配體對治療藥物進行修飾，或通過物理擠壓于表面涂覆癌細胞膜。研究發現，纖連蛋白（FN）在其中心的細胞結合結構域具有RGD（Arg-Gly-Asp）多肽序列，因此可以被視為一種靶向配體，以靶向具有高水平αvβ3整合素表達的癌細胞。由于其良好的生物相容性和生物降解性，FN可以與TAF納米復合物結合構建用于有效癌癥治療的納米藥物制劑。
眾所周知，化療和CDT都可以通過誘導腫瘤細胞的免疫原性細胞死亡（ICD）來引發抗腫瘤免疫。ICD腫瘤細胞可以分泌三磷酸腺苷（ATP），將鈣網蛋白（CRT）從內質網轉移到細胞表面，并從細胞核中釋放高遷移率族蛋白-1（HMGB-1）。這些損傷相關的分子模式可以促進樹突狀細胞（DC）的成熟，并進一步激活天然T細胞轉化為細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）。盡管ICD腫瘤細胞具有一定的免疫激活效果，但直接激活免疫系統殺死腫瘤細胞的免疫療法目前已成為極具發展前景的癌癥治療模式，主要包括免疫檢查點阻斷（ICB）療法、基于T細胞的過繼免疫療法以及腫瘤疫苗等。由于腫瘤細胞總是通過異常表達免疫檢查點（例如程序性細胞死亡配體-1（PD-L1））來逃避T細胞的識別，造成腫瘤的免疫逃逸，因此ICB阻斷治療可以抑制腫瘤細胞的免疫逃逸，恢復T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力，從而逆轉TME的免疫抑制。綜上所述，整合ICD和ICB治療手段可增強腫瘤的治療效果，實現協同的腫瘤免疫治療。
為解決小分子化療藥物不可避免的副作用、腫瘤免疫逃逸以及復發等問題，利用FN的修飾促進藥物的靶向遞送，聯合化療及CDT實現增強的ICD，輔以A-PD-L1免疫檢查點阻斷療法，完成增強的腫瘤免疫治療及MR成像，東華大學史向陽教授團隊構建了一種纖連蛋白包覆的金屬-多酚網絡，通過增強的鐵死亡介導的ICD，用于協同的腫瘤化學/化學動力學/免疫治療以及MR成像（圖1）。
圖1. DOX-TAF@FN納米復合物的制備及其用于體內MR成像和腫瘤的化學/化學動力學/免疫聯合治療示意圖。
研究團隊首先在DOX存在的情況下，利用TA與Fe3+之間的配位作用原位形成負載DOX的TAF（DOX-TAF）納米復合物。隨后，通過氫鍵作用力將FN包覆于DOX-TAF的表面制備納米復合物DOX-TAF-FN。制備的DOX-TAF-FN復合物尺寸分布均勻，平均粒徑為45.0 nm。
團隊通過UV-vis、SDS-PAGE等手段證明了DOX-TAF@FN的成功制備（圖2a-f），且其在水、PBS以及培養基中具有良好的膠體穩定性（圖2g）。制備的DOX-TAF@FN在弱酸性條件下（pH=5.5）能夠顯著釋放鐵離子（41.7%）（圖2h）。此外，亞甲基藍（MB）降解實驗結果表明，DOX-TAF@FN具有催化H2O2產生?OH的特性（圖2i），從而誘導CDT。
圖2.（a-c）DOX-TAF@FN的TEM圖及尺寸分布直方圖；（d）不同材料的紫外-可見光譜；（e）不同材料的SDS-PAGE分析；（f）不同材料的Zeta電位；（g）DOX-TAF@FN納米復合物分散在水、PBS及細胞培養基的粒徑變化；（h）不同條件下DOX-TAF@FN復合物的Fe釋放；（i）在H2O2（10 mM）存在下與DOX-TAF@FN納米復合物在不同條件下孵育后剩余MB的百分比。
該研究以小鼠黑色素瘤（B16）為模型進行了體外、體內研究，在細胞毒性實驗中，隨著Fe濃度的增加，TAF和TAF@FN納米復合物對B16細胞表現出輕微的細胞毒性，這可能歸因于Fe(II)誘導的CDT效應（圖3a）。DOX-TAF和DOX-TAF@FN均表現出DOX濃度依賴性的細胞活力衰減，并且由于化療和CDT的組合，表現出更有效的抑制效果（圖3b）。而ICP結果表明，所有復合物都顯示出在相同Fe濃度下時間依賴性的細胞攝取。在相同的時間點下，B16細胞對Fe的攝取量由大到小為DOX-TAF@FN > DOX-TAF@BSA > DOX-TAF。表明FN可使復合物對表達αvβ3整合素的癌細胞具有靶向特異性（圖3c）。細胞內ROS、GSH以及LPO研究結果表明，DOX-TAF@FN能夠引起細胞內的ROS（圖3d-e）和LPO（圖3g）的顯著增加，且導致細胞內GSH（圖3f）的下降。金屬離子螯合劑DFO被用于驗證細胞內ROS、GSH以及LPO水平的變化是否與Fe相關，結果表明Fe是DOX-TAF@FN在細胞內發生CDT引起鐵死亡的主要因素。
通過Western blot實驗結果表明DOX-TAF@FN顯著抑制了SLC7A11和GPX4的表達（圖3h）。這些結果表明在經過DOX-TAF@FN處理后，細胞內發生了CDT，且引起腫瘤細胞發生了鐵死亡。胞外ATP和HMGB-1的研究結果表明，DOX-TAF@FN能夠增加ATP（圖4a）及HMGB-1（圖4b）的釋放。通過Western blot實驗定量結果以及激光共聚焦顯微鏡定性結果表明，DOX-TAF@FN能夠引起胞內大量的CRT外翻至細胞膜上（圖4c-d），證明了B16細胞ICD的發生。通過Transwell實驗及ELISA實驗證明，DOX-TAF@FN所引起的ICD能夠激活樹突細胞，使樹突細胞活化（圖4e-g）。
圖3.（a-b）不同材料處理的細胞活力檢測結果；（c）細胞吞噬檢測情況；（d-e）經不同材料處理后細胞內ROS變化情況；（f）細胞內GSH水平變化情況；（g）細胞內LPO變化情況；（h）細胞內SLC7A11和GPX4表達水平變化（Ⅰ：PBS；Ⅱ：DOX；Ⅲ：TAF；Ⅳ：DOX-TAF@BSA；Ⅴ：DOX-TAF@FN；Ⅵ：DOX-TAF@FN+DFO；VII：DOX-TAF@FN+Fer-1）。
圖4.（a）B16細胞外ATP的釋放量；（b）胞外HMGB-1的釋放量；（c-d）細胞膜上CRT的表達情況；（e）B16細胞和未成熟的樹突細胞（iDC）共培養的示意圖；（f）樹突細胞的流式分析；（g）樹突細胞TNF-α的分泌量。
隨后，研究團隊研究了DOX-TAF@FN在B16皮下瘤模型中的MR成像性能以及體內抗腫瘤免疫效應。實驗結果表明，該材料具有良好的MR成像效果（圖5a，c-e），且通過體內組織分布結果發現DOX-TAF@FN能夠在腫瘤部位發生聚集，并可通過網狀內皮系統進行代謝（圖5b，f）。
圖5.（a）DOX-TAF@FN的MR成像特性檢測；（b）腫瘤部位的組織分布結果；（c-e）體內MR成像結果；（f）體內組織分布結果。
抗腫瘤活性及免疫效應結果表明，通過對治療期間小鼠體重的統計表明DOX-TAF@FN及A-PD-L1無明顯系統毒性（圖6b），在14天治療結束后經DOX-TAF@FN+A-PD-L1處理的腫瘤體積最小，即表現出最強的腫瘤抑制效果（圖6c-e）。通過對腫瘤部位的免疫組織學觀察，Ki-67染色結果表明DOX-TAF@FN+A-PD-L1組的腫瘤部位細胞增殖率遠低于其他組（圖6f），明顯地抑制了腫瘤細胞的增殖。對腫瘤部位的CRT染色結果表明，DOX-TAF@FN+A-PD-L1組增強了腫瘤細胞的免疫原性死亡效應（圖6f）。通過免疫熒光染色結果表明，DOX-TAF@FN+A-PD-L1組表現出良好的CD8+ T細胞的腫瘤浸潤效果（圖6f），表明了DOX-TAF@FN+A-PD-L1的聯合治療能夠明顯地激活小鼠體內的免疫反應，增強體內的抗腫瘤免疫效應。隨后進一步分析了體內的免疫細胞表達情況，流式分析結果表明，經DOX-TAF@FN+A-PD-L1聯合治療，腫瘤部位的CD4+、CD8+ T細胞（圖7a，d-e）表達上調，調節性T細胞（Tregs）顯著下調（圖7b，f），NK細胞（NK1.1）表達上調（圖7c，g），證明通過化學/化學動力學/免疫聯合治療能夠有效地緩解腫瘤部位的免疫抑制微環境，防止腫瘤的免疫逃逸，增強體內的抗腫瘤免疫反應。
圖6.（a）小鼠體內治療過程示意圖；（b-c）治療14天內小鼠體重及腫瘤體積變化曲線；（d-e）治療第14天腫瘤照片與質量；（f）治療第14天腫瘤切片的Ki-67、CRT及CD8+染色結果。
圖7.（a）腫瘤部位CD4+、CD8+T細胞的流式分析；（b）Tregs（CD25+CD4+Foxp3+ T細胞）的流式分析；（c）NK細胞（NK1.1+）的流式分析；（d-e）CD4+、CD8+T細胞的流式定量圖；（f）Tregs（CD25+CD4+Foxp3+ T細胞）的流式定量圖；（g）NK細胞（NK1.1+）的流式定量圖。
簡言之，該研究設計的DOX-TAF@FN納米平臺的主要優勢在于以下幾個方面：1）使用簡單且生物相容性的成分形成的DOX-TAF@FN納米復合物能夠實現MR成像引導下的靶向腫瘤化學/化學動力學/免疫聯合治療；2）通過化療聯合CDT，增強鐵死亡介導的ICD，從而激活免疫細胞；3）DOX-TAF@FN納米復合物可以通過與A-PD-L1的結合來實現增強的腫瘤治療，增強抗腫瘤免疫反應。該研究制備的DOX-TAF@FN提出了一個真正多功能化和協作的治療診斷納米藥物，可用于靶向腫瘤MR成像和聯合治療，為構建新型納米診療藥物促進臨床轉化奠定了基礎。
以上研究成果以“Fibronectin-Coated Metal-Phenolic Networks for Cooperative Tumor Chemo/Chemodynamic/Immune Therapy via Enhanced Ferroptosis-Mediated Immunogenic Cell Death”為題，在線發表于國際著名期刊ACS Nano (DOI: 10.1021/acsnano.1c08585) 。東華大學化學化工與生物工程學院史向陽教授為通訊作者，碩士生徐瑤為第一作者。該工作得到了國家自然科學基金面上項目、上海市科委政府間國際科技合作項目、上海市科委優秀學術帶頭人計劃及國家自然科學基金國際（地區）合作與交流項目等項目的資助。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c08585
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