傳統(tǒng)的小分子藥物化療存在水溶性和生物利用度低、治療效果差、對正常組織致死率高、易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除等問題。為了完成藥物對腫瘤的靶向遞送，人們構(gòu)建了多種納米平臺，賦予化療藥物特異性靶向能力和延長的血液循環(huán)時間。近年來，新一代納米平臺的設計重點是“一體化”策略，即一種整合癌癥治療學的診斷和治療元素的策略。然而，構(gòu)建簡單和具有生物相容性成分的“一體化”納米平臺以促進多模式腫瘤治療仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。
最近的研究表明，通過多酚和金屬離子的配位形成的金屬-酚類網(wǎng)絡可將化療藥物負載在其疏水腔中。例如，具有優(yōu)異生物安全性和生物相容性的天然植物多酚單寧酸（TA），它易于螯合Fe3+形成穩(wěn)定且對pH較敏感的TA-Fe（TAF）納米復合物，可用于在酸性腫瘤微環(huán)境（TME）中化療藥物的pH響應性釋放。更重要的是，TAF納米復合物中的Fe3+可用于化學動力學治療（CDT），從而誘導癌細胞的鐵死亡（一種新興的程序性細胞死亡形式）。簡而言之，TAF在TME中解離后，TA可以將Fe3+轉(zhuǎn)化為Fe2+，然后Fe2+可與癌細胞中過表達的過氧化氫（H2O2）觸發(fā)Fenton反應，生成細胞毒性羥基自由基（?OH），并進一步消耗細胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）增強誘導癌細胞死亡。通過這種方式，載有化療藥物的TAF納米復合物可以實現(xiàn)CDT和化療的聯(lián)合。此外，在TME下TAF納米復合物解離的鐵離子具有r1弛豫率，從而實現(xiàn)T1加權(quán)的MR成像。
對于納米平臺中的靶向輸送系統(tǒng)，已有研究人員通過化學偶聯(lián)等方法用各種靶向配體對治療藥物進行修飾，或通過物理擠壓于表面涂覆癌細胞膜。研究發(fā)現(xiàn)，纖連蛋白（FN）在其中心的細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有RGD（Arg-Gly-Asp）多肽序列，因此可以被視為一種靶向配體，以靶向具有高水平αvβ3整合素表達的癌細胞。由于其良好的生物相容性和生物降解性，F(xiàn)N可以與TAF納米復合物結(jié)合構(gòu)建用于有效癌癥治療的納米藥物制劑。
眾所周知，化療和CDT都可以通過誘導腫瘤細胞的免疫原性細胞死亡（ICD）來引發(fā)抗腫瘤免疫。ICD腫瘤細胞可以分泌三磷酸腺苷（ATP），將鈣網(wǎng)蛋白（CRT）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到細胞表面，并從細胞核中釋放高遷移率族蛋白-1（HMGB-1）。這些損傷相關的分子模式可以促進樹突狀細胞（DC）的成熟，并進一步激活天然T細胞轉(zhuǎn)化為細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）。盡管ICD腫瘤細胞具有一定的免疫激活效果，但直接激活免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞的免疫療法目前已成為極具發(fā)展前景的癌癥治療模式，主要包括免疫檢查點阻斷（ICB）療法、基于T細胞的過繼免疫療法以及腫瘤疫苗等。由于腫瘤細胞總是通過異常表達免疫檢查點（例如程序性細胞死亡配體-1（PD-L1））來逃避T細胞的識別，造成腫瘤的免疫逃逸，因此ICB阻斷治療可以抑制腫瘤細胞的免疫逃逸，恢復T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力，從而逆轉(zhuǎn)TME的免疫抑制。綜上所述，整合ICD和ICB治療手段可增強腫瘤的治療效果，實現(xiàn)協(xié)同的腫瘤免疫治療。
為解決小分子化療藥物不可避免的副作用、腫瘤免疫逃逸以及復發(fā)等問題，利用FN的修飾促進藥物的靶向遞送，聯(lián)合化療及CDT實現(xiàn)增強的ICD，輔以A-PD-L1免疫檢查點阻斷療法，完成增強的腫瘤免疫治療及MR成像，東華大學史向陽教授團隊構(gòu)建了一種纖連蛋白包覆的金屬-多酚網(wǎng)絡，通過增強的鐵死亡介導的ICD，用于協(xié)同的腫瘤化學/化學動力學/免疫治療以及MR成像（圖1）。
圖1. DOX-TAF@FN納米復合物的制備及其用于體內(nèi)MR成像和腫瘤的化學/化學動力學/免疫聯(lián)合治療示意圖。
研究團隊首先在DOX存在的情況下，利用TA與Fe3+之間的配位作用原位形成負載DOX的TAF（DOX-TAF）納米復合物。隨后，通過氫鍵作用力將FN包覆于DOX-TAF的表面制備納米復合物DOX-TAF-FN。制備的DOX-TAF-FN復合物尺寸分布均勻，平均粒徑為45.0 nm。
團隊通過UV-vis、SDS-PAGE等手段證明了DOX-TAF@FN的成功制備（圖2a-f），且其在水、PBS以及培養(yǎng)基中具有良好的膠體穩(wěn)定性（圖2g）。制備的DOX-TAF@FN在弱酸性條件下（pH=5.5）能夠顯著釋放鐵離子（41.7%）（圖2h）。此外，亞甲基藍（MB）降解實驗結(jié)果表明，DOX-TAF@FN具有催化H2O2產(chǎn)生?OH的特性（圖2i），從而誘導CDT。
圖2.（a-c）DOX-TAF@FN的TEM圖及尺寸分布直方圖；（d）不同材料的紫外-可見光譜；（e）不同材料的SDS-PAGE分析；（f）不同材料的Zeta電位；（g）DOX-TAF@FN納米復合物分散在水、PBS及細胞培養(yǎng)基的粒徑變化；（h）不同條件下DOX-TAF@FN復合物的Fe釋放；（i）在H2O2（10 mM）存在下與DOX-TAF@FN納米復合物在不同條件下孵育后剩余MB的百分比。
該研究以小鼠黑色素瘤（B16）為模型進行了體外、體內(nèi)研究，在細胞毒性實驗中，隨著Fe濃度的增加，TAF和TAF@FN納米復合物對B16細胞表現(xiàn)出輕微的細胞毒性，這可能歸因于Fe(II)誘導的CDT效應（圖3a）。DOX-TAF和DOX-TAF@FN均表現(xiàn)出DOX濃度依賴性的細胞活力衰減，并且由于化療和CDT的組合，表現(xiàn)出更有效的抑制效果（圖3b）。而ICP結(jié)果表明，所有復合物都顯示出在相同F(xiàn)e濃度下時間依賴性的細胞攝取。在相同的時間點下，B16細胞對Fe的攝取量由大到小為DOX-TAF@FN > DOX-TAF@BSA > DOX-TAF。表明FN可使復合物對表達αvβ3整合素的癌細胞具有靶向特異性（圖3c）。細胞內(nèi)ROS、GSH以及LPO研究結(jié)果表明，DOX-TAF@FN能夠引起細胞內(nèi)的ROS（圖3d-e）和LPO（圖3g）的顯著增加，且導致細胞內(nèi)GSH（圖3f）的下降。金屬離子螯合劑DFO被用于驗證細胞內(nèi)ROS、GSH以及LPO水平的變化是否與Fe相關，結(jié)果表明Fe是DOX-TAF@FN在細胞內(nèi)發(fā)生CDT引起鐵死亡的主要因素。
通過Western blot實驗結(jié)果表明DOX-TAF@FN顯著抑制了SLC7A11和GPX4的表達（圖3h）。這些結(jié)果表明在經(jīng)過DOX-TAF@FN處理后，細胞內(nèi)發(fā)生了CDT，且引起腫瘤細胞發(fā)生了鐵死亡。胞外ATP和HMGB-1的研究結(jié)果表明，DOX-TAF@FN能夠增加ATP（圖4a）及HMGB-1（圖4b）的釋放。通過Western blot實驗定量結(jié)果以及激光共聚焦顯微鏡定性結(jié)果表明，DOX-TAF@FN能夠引起胞內(nèi)大量的CRT外翻至細胞膜上（圖4c-d），證明了B16細胞ICD的發(fā)生。通過Transwell實驗及ELISA實驗證明，DOX-TAF@FN所引起的ICD能夠激活樹突細胞，使樹突細胞活化（圖4e-g）。
圖3.（a-b）不同材料處理的細胞活力檢測結(jié)果；（c）細胞吞噬檢測情況；（d-e）經(jīng)不同材料處理后細胞內(nèi)ROS變化情況；（f）細胞內(nèi)GSH水平變化情況；（g）細胞內(nèi)LPO變化情況；（h）細胞內(nèi)SLC7A11和GPX4表達水平變化（Ⅰ：PBS；Ⅱ：DOX；Ⅲ：TAF；Ⅳ：DOX-TAF@BSA；Ⅴ：DOX-TAF@FN；Ⅵ：DOX-TAF@FN+DFO；VII：DOX-TAF@FN+Fer-1）。
圖4.（a）B16細胞外ATP的釋放量；（b）胞外HMGB-1的釋放量；（c-d）細胞膜上CRT的表達情況；（e）B16細胞和未成熟的樹突細胞（iDC）共培養(yǎng)的示意圖；（f）樹突細胞的流式分析；（g）樹突細胞TNF-α的分泌量。
隨后，研究團隊研究了DOX-TAF@FN在B16皮下瘤模型中的MR成像性能以及體內(nèi)抗腫瘤免疫效應。實驗結(jié)果表明，該材料具有良好的MR成像效果（圖5a，c-e），且通過體內(nèi)組織分布結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOX-TAF@FN能夠在腫瘤部位發(fā)生聚集，并可通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)進行代謝（圖5b，f）。
圖5.（a）DOX-TAF@FN的MR成像特性檢測；（b）腫瘤部位的組織分布結(jié)果；（c-e）體內(nèi)MR成像結(jié)果；（f）體內(nèi)組織分布結(jié)果。
抗腫瘤活性及免疫效應結(jié)果表明，通過對治療期間小鼠體重的統(tǒng)計表明DOX-TAF@FN及A-PD-L1無明顯系統(tǒng)毒性（圖6b），在14天治療結(jié)束后經(jīng)DOX-TAF@FN+A-PD-L1處理的腫瘤體積最小，即表現(xiàn)出最強的腫瘤抑制效果（圖6c-e）。通過對腫瘤部位的免疫組織學觀察，Ki-67染色結(jié)果表明DOX-TAF@FN+A-PD-L1組的腫瘤部位細胞增殖率遠低于其他組（圖6f），明顯地抑制了腫瘤細胞的增殖。對腫瘤部位的CRT染色結(jié)果表明，DOX-TAF@FN+A-PD-L1組增強了腫瘤細胞的免疫原性死亡效應（圖6f）。通過免疫熒光染色結(jié)果表明，DOX-TAF@FN+A-PD-L1組表現(xiàn)出良好的CD8+ T細胞的腫瘤浸潤效果（圖6f），表明了DOX-TAF@FN+A-PD-L1的聯(lián)合治療能夠明顯地激活小鼠體內(nèi)的免疫反應，增強體內(nèi)的抗腫瘤免疫效應。隨后進一步分析了體內(nèi)的免疫細胞表達情況，流式分析結(jié)果表明，經(jīng)DOX-TAF@FN+A-PD-L1聯(lián)合治療，腫瘤部位的CD4+、CD8+ T細胞（圖7a，d-e）表達上調(diào)，調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）顯著下調(diào)（圖7b，f），NK細胞（NK1.1）表達上調(diào)（圖7c，g），證明通過化學/化學動力學/免疫聯(lián)合治療能夠有效地緩解腫瘤部位的免疫抑制微環(huán)境，防止腫瘤的免疫逃逸，增強體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應。
圖6.（a）小鼠體內(nèi)治療過程示意圖；（b-c）治療14天內(nèi)小鼠體重及腫瘤體積變化曲線；（d-e）治療第14天腫瘤照片與質(zhì)量；（f）治療第14天腫瘤切片的Ki-67、CRT及CD8+染色結(jié)果。
圖7.（a）腫瘤部位CD4+、CD8+T細胞的流式分析；（b）Tregs（CD25+CD4+Foxp3+ T細胞）的流式分析；（c）NK細胞（NK1.1+）的流式分析；（d-e）CD4+、CD8+T細胞的流式定量圖；（f）Tregs（CD25+CD4+Foxp3+ T細胞）的流式定量圖；（g）NK細胞（NK1.1+）的流式定量圖。
簡言之，該研究設計的DOX-TAF@FN納米平臺的主要優(yōu)勢在于以下幾個方面：1）使用簡單且生物相容性的成分形成的DOX-TAF@FN納米復合物能夠?qū)崿F(xiàn)MR成像引導下的靶向腫瘤化學/化學動力學/免疫聯(lián)合治療；2）通過化療聯(lián)合CDT，增強鐵死亡介導的ICD，從而激活免疫細胞；3）DOX-TAF@FN納米復合物可以通過與A-PD-L1的結(jié)合來實現(xiàn)增強的腫瘤治療，增強抗腫瘤免疫反應。該研究制備的DOX-TAF@FN提出了一個真正多功能化和協(xié)作的治療診斷納米藥物，可用于靶向腫瘤MR成像和聯(lián)合治療，為構(gòu)建新型納米診療藥物促進臨床轉(zhuǎn)化奠定了基礎。
以上研究成果以“Fibronectin-Coated Metal-Phenolic Networks for Cooperative Tumor Chemo/Chemodynamic/Immune Therapy via Enhanced Ferroptosis-Mediated Immunogenic Cell Death”為題，在線發(fā)表于國際著名期刊ACS Nano (DOI: 10.1021/acsnano.1c08585) 。東華大學化學化工與生物工程學院史向陽教授為通訊作者，碩士生徐瑤為第一作者。該工作得到了國家自然科學基金面上項目、上海市科委政府間國際科技合作項目、上海市科委優(yōu)秀學術帶頭人計劃及國家自然科學基金國際（地區(qū)）合作與交流項目等項目的資助。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c08585
- 暫無相關新聞
