探究聚合物多級結構與其性質及功能之間的關系是高分子科學領域一個永恒的主題。相關研究對于高分子材料的理性設計以及生物功能的調控具有重要意義。然而，由于真實生物及材料體系的復雜性，傳統體相平均實驗方法難于定量建立這種聯系。通過將真實體系進行模塊化分割，提取出其中的關鍵要素，從微納尺度乃至單分子水平進行研究，是建立上述聯系的有效途徑。單分子力譜技術可以對單個聚合物鏈進行操縱，提供皮牛頓級別的力學測量精度以及亞納米尺度的空間分辨率，成為研究聚合物納米力學性質（包括分子內、分子間相互作用等）以及鏈結構與其動態行為的有效方法。
吉林大學張文科教授課題組結合其在相關領域的工作積累，近期在《Macromolecules》上發表了題為“Manipulation of a Single Polymer Chain: From the Nanomechanical Properties to Dynamic Structure Evolution”的前景展望（Perspective）文章。該文章首先簡要介紹了聚合物分子偶聯及探針選擇對單分子操縱實驗的重要性。接著總結了近年來基于原子力顯微鏡技術（AFM）的單分子力譜方法在研究聚合物結構與納米尺度力學性質方面的進展，包括聚合物單晶納米力學性質、聚合物共價力化學以及聚合物納米復合材料體系。隨后總結了基于AFM的單分子力譜及單分子磁鑷技術在研究具有重復序列的長鏈DNA高級結構及其動態演化機制（圖1）。最后，討論了聚合物單分子操縱領域的未來挑戰和機遇。作者希望該文能引起材料、生物和理論模擬與計算等研究領域的相關人員的進一步關注與參與，深化對聚合物結構-性能（功能）關系的理解。
圖1. 單分子力譜技術（SMFS）在材料和生物體系中的應用。
（一）聚合物納米力學性質
研究半結晶聚合物鏈組成與鏈間相互作用及鏈折疊/解折疊等動態結構演化之間的聯系，對于高分子材料的設計、加工和使役具有重要的意義。半結晶性高分子材料通常由結晶相及無定形相等多級結構組成，其在受力形變過程中往往伴隨著無定形相拉伸、片晶熔融、無定形鏈滑移、拉伸誘導結晶以及共價鍵斷裂等多層次的結構演化過程（圖2）。上述過程往往還會發生疊加，難以提取出某一結構（例如片晶）對材料力學性質的貢獻，導致宏觀拉伸實驗難以建立結構與力學性質間的聯系。
圖2. 半結晶性高分子材料在拉伸過程中的多層次結構演化示意圖。（1）無定形相拉伸；（2）片晶中聚合物鏈解折疊與結晶相熔融；（3）無定形鏈滑移穿越片晶結構；（4）拉伸誘導結晶；（5）共價鍵斷裂。
1．聚合物單晶的納米力學性質
聚合物單晶是研究半結晶聚合物材料力致熔融行為和鏈折疊的理想體系。張文科教授課題組于2011年首次報道了聚氧乙烯（PEO）單晶體系納米力學性質的研究結果。通過將原子力顯微鏡（AFM）成像與單分子力譜技術有機結合，并輔以合適的樣品制備及偶聯方法，成功地將單條高分子鏈從PEO晶體中提拉出來，定量測量了晶體中高分子鏈間作用力的大小（J. Am. Chem. Soc., 2011,133, 322）。在此基礎上，該課題組進一步克服樣品制備等難題，將其發展成一種普適性的研究方法，成功地將該方法應用到聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、尼龍66（PA66）、尼龍6（PA6）、聚乳酸（PLLA）和聚己內酯（PCL）等眾多高分子晶體體系當中。結合聚合物單分子力譜和受控分子動力學模擬，系統考察了晶體中聚合物鏈構象（螺旋，平面鋸齒，非平面鋸齒）鏈組成、折疊模式以及外界環境等對納米力學性質的影響規律。建立了晶體中高分子鏈構象與鏈運動模式之間的聯系：螺旋鏈在受力拉伸時采取螺旋運動模式，力值變化較平穩、波動較小，而鋸齒鏈會發生粘滑運動（stick-slip）導致力值出現鋸齒狀波動（Langmuir, 2017, 33, 1826; Macromolecules, 2019, 52, 1327），同時首次通過單分子實驗觀測到PA66及PA6晶體中高分子鏈在受力形變過程中多重氫鍵的動態斷裂與重新形成過程，發現高分子鏈在晶體中滑動過程中進行高速旋轉直至氫鍵重新形成（ACS Macro Lett., 2018,7, 762）。基于上述具有指紋特征的力譜，考察了聚合物鏈的折疊模式對單分子納米力學性質的影響規律：非近鄰折疊結構的存在會使得力致熔融過程中既包含聚合物鏈的解折疊又包含無定形鏈在晶體中的穿行兩個過程，導致力學響應信號的疊加。對于鋸齒構象的聚合物鏈，其熔融力曲線體現為小鋸齒狀平臺上面的大鋸齒的出現（圖3B，3C中的綠色曲線）；對于螺旋構象的聚合物鏈，非近鄰折疊會導致更高力值的長平臺力學信號的出現。基于上述信息，該課題組成功地建立了高分子晶體中鏈折疊模式的定量化研究新方法，該方法無需對樣品進行標記，具有很好的普適性，研究結果顯示溶液相制備的高分子晶體中近鄰規整折疊模式所占比例很高（≥91%），表明分子內相互作用對結晶過程起到了關鍵作用（ACS Macro Lett., 2019, 8, 1194， ACS Editors’ Choice）。通過化學修飾和條件優化，建立了空氣相聚合物單分子力譜方法，顯著提升了力學測量精度（從23 pN提升至4 pN）以及拉伸速率（從10 μm/s提高至100 μm/s），并成功檢測到PEO折疊鏈所形成的環形鏈（loop）結構在晶體中受力運動的中間態（Macromolecules, 2018, 51, 7052）。同時發現晶體所處環境對納米力學性質影響顯著，聚合物與周圍介質的界面能越高，熔融力值越高，晶體力學穩定性越好。
圖3. 聚合物鏈在晶體中的折疊模式對其納米力學性質的影響以及基于力學指紋譜的折疊模式定量化研究。
2. 共價力化學
在極端拉伸條件下，聚合物鏈有可能會發生分子內共價鍵的斷裂，誘導共價力化學反應的發生。研究外力沿著聚合物鏈的傳遞規律，并定量化力化學反應發生的機制是力化學研究的重要內容之一。AFM-SMFS方法是唯一能定量分析力化學反應所需外力及其動力學過程的實驗方法，相關研究對于開發新型力色團、調控材料韌性及自修復等性能具有重要的意義。在該展望文章中，作者討論了相關領域的一些近期研究進展，包括力色團在聚合物主鏈中的連接方式以及力色團中隱藏的鏈長對力學性質的影響（Nat. Commun., 2017, 8:1147)、外力誘導螺噻喃可逆開環異構化反應及由此引發的點擊化學反應（Nano Res., 2020, 14, 2654）圖4），以及外力誘導的聚合物主鏈釋放HCl的反應和由此引發的顯色反應(Craig et al., J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 99)等等。
圖4. 力誘導螺噻喃異構化及其點擊化學反應。
3. 聚合物納米復合物
了解聚合物與納米粒子之間的作用強度、影響因素以及復合過程的動力學，對于調控納米復合物的性質、設計高性能聚合物納米復合物材料（如，納米載藥體系）具有重要意義。該展望文章評述了以單個聚合物鏈為探針，采用AFM-SMFS方法研究聚合物與納米物質形成的復合物的納米力學性質方面的進展。主要包括，納米粒子的形狀、尺寸及表面電荷密度等對多金屬氧簇-聚賴氨酸復合體系相互作用的影響（Langmuir, 2017, 33, 7615）；溶液離子強度對聚陽離子基因載體材料PEI與雙鏈DNA間結合強度的顯著影響（ACS Appl. Mater. Inter. 2016, 8, 21055）。還討論了單股DNA在手性碳納米管表面進行纏繞組裝以及DNA序列、納米管手性以及鹽溶液對所形成的納米組裝體結構及力學性質的影響規律（Nanoscale, 2018, 10, 18586）。在純水中，DNA與納米管在π-π及疏水效應作用驅動下纏繞形成螺旋結構；在PBS溶液中，復合物的形成分兩步進行：首先是在π-π及疏水效應作用下發生DNA在納米管上的吸附及纏繞，鹽溶液可以消除相鄰DNA鏈段之間的靜電排斥作用，從而在氫鍵驅動下形成更加緊密纏繞的螺旋結構，體現出更高的力學穩定性（圖5）。
圖5. 鹽溶液對單股DNA與手性碳納米管的組裝/解組裝過程的影響。
（二）DNA的高級結構及其動態演化
對于一些分子量較大、難以采用核磁及X-射線結晶衍射等方法進行結構解析的聚合物樣品體系，通過采用單分子力譜方法并結合CD等傳統實驗技術，可以較好地研究這些聚合物所形成的高級結構及其動態演化過程。該展望文章分別介紹了其研究組在利用AFM-SMFS方法研究帶有重復序列的長鏈端粒DNA的高級結構及其在外力誘導下的結構演化機制，討論了DNA樣品制備與偶聯方法創新對成功開展相關實驗的重要性。對雙鏈端粒DNA體系，發現機械力可以觸發雙鏈端粒DNA的熔融以及高級結構的形成。只有在兩條鏈都分別形成G-四鏈體和i-motif結構的條件下，這些四鏈體結構才能穩定存在，雙螺旋DNA的再次復性才能被有效阻止（Nucleic Acids Res., 2020, 48, 6458）。溶液中引入K+、單壁碳納米管、酸性條件或是富含G的短片段均有利于實現將平衡從雙螺旋復性向高級結構形成的方向轉移（圖6）。上述研究工作為端粒DNA結構的調控提供了一種新的途徑和思路。
圖6. 雙鏈端粒DNA的動態拓撲結構演化示意圖。
對于單股端粒DNA鏈，首次探測到長串聯G-四鏈體中存在一種新型的不完整折疊結構，即含有G空缺的pre-GQ，其特點是四鏈體外側存在多個對稱的G空缺（CCS Chem., 2021, 3, 3192）。該長鏈端粒DNA的折疊過程主要可分為兩步，首先快速折疊成G-發夾結構（G-hairpin），接著外側的鳥嘌呤緩慢地折疊進入到空缺位置形成pre-GQ，較高濃度的PEG可以加快這一過程（圖7）。這些發現有助于人們更好地認識長鏈端粒末端的真實結構，為抗癌藥物的設計提供新的思路。
圖7. 人類端粒長鏈ssDNA的動態結構演化示意圖。
此外，利用單分子磁鑷技術的高的力學精度及系統穩定性，研究了凝血酶適體重復序列所形成的高級結構。采用新開發的換酶滾環擴增法，制備了末端帶有多個生物素分子修飾的單股DNA，實現了目標分子在磁球與基片之間的穩定偶聯。通過單分子磁鑷并結合AFM成像實驗，發現長鏈凝血酶適配體ssDNA內部存在一種由重復序列堆積形成的新型棒狀G-四鏈體結構，且凝血酶的加入可以促進更長的棒狀結構的形成（圖7，Nanoscale, 2020, 12, 4159）。這項工作所開發的方法原則上適用于基因組中廣泛存在的其他重復序列體系的研究。單分子磁鑷系統的穩定性及高的力學靈敏度，使其還可以研究由重復序列的DNA與組蛋白所形成的核小體的動態組裝、單個聚合物鏈的結晶成核及鏈-球（coil-globule）轉變等相變過程的研究。
圖8. 凝血酶適體重復序列的制備及所形成的新型棒狀結構。
（三）前景與挑戰
盡管 SMFS在建立聚合物的微觀結構（或構象）及其動態結構演變與納米力學性能和生物功能關系方面展示出廣闊的應用前景，但在真實的材料和生物體系研究方面仍有許多問題需要解決。一方面對于聚合物材料體系，單晶的性質不能完全反映復雜體系（同時包含結晶相和無定形相）的真實性質，已建立的力學指紋譜對未來研究非晶相對材料納米力學性質的影響奠定了堅實的基礎。此外，對于非晶聚合物凝聚態的納米力學性質研究是另一個具有挑戰性的課題。通過結合理論模擬、超分辨光譜等技術將有力地促進該領域的發展。另一方面，對于單鏈力化學領域，SMFS技術僅能提供力和長度信息，難以給出明確的化學信息，通過原位聯用其他具有化學組成分辨能力的光譜技術，將賦予SMFS新的活力。在生物體系中，基于AFM的力譜技術尚不能定量外力負載下的化學生物學反應，將SMFS技術和超分辨顯微鏡進行結合有可能為該課題帶來創造性的解決方案。總之，這些領域的發展取決于新技術和新實驗/理論方法的建立。這些領域雖然充滿挑戰，但也為研究人員提供了充分發揮想象力和創造力的空間。
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.macromol.2c00076
