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天津大學王澤方教授團隊《Nat. Commun.》:工程化酵母全細胞催化系統實現高結晶PET塑料高效降解
2022-12-05  來源:高分子科技


  聚對苯二甲酸乙二醇酯 (Polyethylene terephthalate,PET) 是一種在服裝、包裝、醫藥等領域廣泛應用的塑料。然而PET產品因其極強的化學、物理穩定性,使得它至少數百年才能在自然界中自發降解,這對全球生態安全和人類健康帶來了巨大威脅。近日,天津大學生命科學學院王澤方教授團隊設計并構建了一種工程化的酵母全細胞生物催化劑,將PETase作為降解模塊、疏水蛋白HFBI作為吸附模塊共同展示在酵母細胞表面,創新性地在酵母細胞表面實現了吸附和降解這兩個步驟的有機統一。相關工作以《Biodegradation of Highly Crystallized Poly(ethylene terephthalate) Through Cell Surface Codisplay of Bacterial PETase and Hydrophobin》為題,于2022年11月21日發表在Nature Communications上。此研究是該課題組近兩年內在生態安全領域(PNAS, 2021, 33876762; PNAS, 2021, 34620712;Nature Communications, 2022, 35338130)的又一重要進展。


  廢棄的PET應該怎么回收處理呢?傳統的物理、化學方法已經被廣泛應用于工業生產,近幾年“吃PET”的酶的相關研究為PET降解開拓了一種綠色道路,它能將PET分解為可重新利用的工業原料,而且同時具備傳統物理法工藝簡單和化學法閉環降解等優點。但是目前利用“吃PET”的酶催化降解低結晶度的PET雖然已經取得了長足進展,有些催化酶的應用甚至已經到達半工業化水平,然而對于高結晶度的PET(用來制作可樂瓶、礦泉水瓶等食品級容器),一直是這些降解酶“消化系統”的短板,降解能力十分有限。天津大學生命科學學院王澤方教授團隊通過將吸附模塊HFBI及降解模塊PETase共展示在酵母細胞表面,構建全細胞催化系統,以解決現存“消化系統”的短板問題,在疏水性的PET界面充分發揮降解酶PETase“消化系統”對高結晶度PET的消化功能,以實現對hcPET的高效降解。


1、酵母全細胞生物催化系統的構建


  王澤方教授團隊構建的酵母全細胞催化系統同時在酵母細胞表面展示疏水蛋白HFBI和PET水解酶PETase,模擬PET降解的兩步過程,即吸附和水解,彌補現有研究對二者割裂以及主要集中在水解步驟的局限。具體實驗中,研究人員將人工設計的吸附模塊疏水蛋白HFBI和降解模塊PETase通過表面共展示技術固定到了畢赤酵母的細胞表面,并通過優化,實現了二者在酵母細胞表面的最佳組合(圖1)。


圖1. 酵母全細胞生物催化系統。(a)吸附模塊疏水蛋白HFBI和降解模塊PETase結構圖;(b)共展示系統示意圖;(c)HFBI和PETase通過表面共展示技術固定到畢赤酵母細胞表面在100 ns的分子動力學模擬示意圖;(d)不同誘導時間下展示在酵母細胞表面的HFBI和PETase免疫熒光圖。


2、疏水蛋白HFBI通過增加酵母細胞表面疏水性增加共展示細胞在PET表面的吸附


  通過Western blot和熒光共聚焦成像驗證吸附模塊疏水蛋白HFBI和降解模塊PETase成功展示在酵母細胞表面后,作者首先利用微生物對碳氫化合物的粘附(MATH)實驗(圖2a-2c),證明酵母細胞表面展示的HFBI是酵母細胞表面疏水性增加的原因;隨后,利用接觸角(WCA)實驗(圖2d-2e),進一步證明HFBI確實可以增加共展示細胞表面的疏水性;最后,為了確認細胞表面展示的HFBI對細胞表面疏水性的影響是否可以轉化為對酵母細胞在PET表面附著的影響,作者觀察了在不同條件下共展示細胞在hcPET表面的吸附,發現共展示細胞幾乎覆蓋了hcPET的所有表面區域,而單展示PETase的對照樣品在相同的條件下在hcPET表面的吸附急劇減少(圖2f)。當使用低濃度的相同的細胞進行結合測定時,也同樣發現類似的吸附差異(圖2g)。這些結果均說明吸附單元HFBI通過增加酵母細胞表面疏水性增加共展示細胞在PET表面的吸附。


圖2. 檢測共展示細胞表面疏水性。(a)MATH實驗示意圖;(b-c)誘導不同時間的共展示細胞MATH實驗結果;(d-e)接觸角實驗測量結果;(f-g)不同條件下共展示細胞及對照樣品在hcPET表面的吸附。


3、酵母全細胞生物催化系統具有高效降解活性


  作者隨后將構建的酵母全細胞生物催化系統用于PET塑料降解。首先探索了共展示細胞水解hcPET的最佳條件,并與純化的PETase進行了比較。結果表明,溫度、pH、蛋白濃度(圖3a-c)均對共展示細胞及PETase的轉化率有明顯的影響,且在每種測試條件下,共展示細胞的酶活性均高于野生型PETase。最終測活結果顯示,全細胞生物催化劑對hcPET(結晶度為45%)的轉化率比野生型PETase提高約328.8倍(圖3d)。然后,作者用掃描電鏡和光學顯微鏡觀察了共展示細胞處理的hcPET的形態變化,使用PETase處理過的hcPET作為對照。如圖3e所示,在PETase處理的hcPET上幾乎沒有表面侵蝕,而共展示細胞處理后hcPET表面有明顯的裂紋和侵蝕。同時,該全細胞催化系統也表現出了較高的穩定性,在10天長時間反應條件下,與野生型PETase對hcPET轉化率0.003%相比,該全細胞催化劑將hcPET的轉化率提高到約10.9%(圖3f)。以上結果說明作者構建的酵母全細胞生物催化系統能夠穩定、高效的降解hcPET。


圖3. 酵母全細胞生物催化系統能夠高效降解hcPET。(a)溫度;(b)pH;(c)蛋白質濃度對PET水解的影響;(d)最佳反應條件下共展示細胞和野生型PETase以PET為底物的轉化率;(e)商用hcPET薄膜與PETase和共展示細胞孵育前后的SEM圖像;(f)最佳反應條件下共展示細胞、單展示PETase細胞及野生型PETase長時間降解hcPET相對降解率。


4、酵母全細胞生物催化系統具有穩定性


  為了測試該共展示細胞能否用于工業規模的全細胞生物催化劑,作者評估了與共展示細胞工業應用相關的幾個特性,包括熱穩定性、可重用性、化學或溶劑穩定性、存儲條件。從圖4a可以看出,在30°C下孵育7天,共展示細胞的相對轉化率保持在100%,說明在這段孵育時間內,酶活性幾乎沒有變化,而且回收7輪之后仍能保持50%酶活(圖4b)。圖4c顯示,當共展示細胞在含有0.1% Triton X-100、10% 甲醇、10% 乙醇中培養時,仍能保持較高酶活。凍干是一種有利于共展示細胞儲存和運輸的脫水過程,從圖4d可以看出,冷凍干燥后共展示細胞對PET的轉化率仍然接近100%,說明全細胞生物催化劑在脫水后幾乎保留了全部的酶活性。綜上所述,構建的酵母全細胞生物催化系統降解hcPET具有穩定性。


圖4. 酵母全細胞生物催化系統降解hcPET具有穩定性。(a)熱穩定性;(b)循環使用性;(c)化學試劑對共展示系統的影響;(d)凍干對共展示系統的影響。


5、酵母全細胞生物催化系統降解hcPET的分子機制


  隨后,作者對該全細胞生物催化系統降解hcPET進行了分子動力學模擬,提出共展示系統通過兩步降解hcPET的分子機制。首先,由于吸附模塊HFBI的存在,共展示細胞迅速吸附到hcPET表面,且在hcPET上的吸附率接近100%。隨后,降解模塊PETase接觸高結晶度PET的表面,并以順式構象水解PET鏈,從而實現高結晶度PET的高效水解(圖5)。說明粘附模塊的引入是該系統高效降解hcPET的關鍵。


圖5. 全細胞催化系統水解hcPET示意圖。


  此項研究提供了一種高效生物降解hcPET的策略,證明了表面展示系統的可塑性,通過在表面展示系統中引入不同的功能模塊,可以大大提高其性能,對開發其它高性能協同表面展示系統具有重要的借鑒意義。


  文章鏈接:https://www.nature.com/articles/s41467-022-34908-z

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(責任編輯:xu)
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