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東華大學(xué)洪楓教授團(tuán)隊(duì)《Int. J. Biol. Macromol.》:彈性絲光化細(xì)菌納米纖維素/聚乙烯醇復(fù)合小口徑人工血管
2023-08-28  來源:高分子科技

  細(xì)菌納米纖維素(Bacterial nanocelluloseBNC)管在小口徑人工血管領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力,然而水凝膠態(tài)下,力學(xué)性能弱、縫合強(qiáng)力較低順應(yīng)性不足等問題,也一定程度上限制了BNC管的應(yīng)用。雖然目前可以通過濃堿處理來制備絲光化BNCMercerized BNCMBNC)以提升BNC管的力學(xué)性能,但是其縫合強(qiáng)力仍然較低,彈性較差,這使得BNCMBNC管的手術(shù)操作變得相對困難。因此東華大學(xué)洪楓教授團(tuán)隊(duì)結(jié)合了濃堿處理技術(shù)和水溶性彈性高分子材料聚乙烯醇(Polyvinyl alcoholPVA)的冷凍相分離技術(shù),制備了具有彈性的絲光化BNC/PVA復(fù)合小口徑人工血管(MBP),評估了其應(yīng)用潛力。該成果以Production of novel elastic bacterial nanocellulose/polyvinyl alcohol conduits via mercerization and phase separation for small-caliber vascular grafts application為題,發(fā)表于International Journal of Biological Macromolecules上。


1 ABNCMBNCMBP管的宏觀形貌圖;(BBNCMBNCMBP管的宏觀截面圖;(C文章設(shè)計(jì)概念圖

聚乙烯醇的引入——絲光化BNC/PVA復(fù)合管結(jié)構(gòu)與物理性能的變化


  圖2A和圖2B分別顯示了BNCMBNCMBP管的內(nèi)表面和外表面的微觀形貌。BNCMBNC管為纖維結(jié)構(gòu),而對于MBP管而言,所有的MBP管的內(nèi)表面和外表面均為多孔結(jié)構(gòu)。與MBP-12.5相比,MBP-10MBP-15的內(nèi)表面雖然有大量的多孔結(jié)構(gòu),也有更多的不規(guī)則塊狀結(jié)構(gòu)或條狀結(jié)構(gòu),而這三種管的外表面都相對均勻。PVA溶液的黏度隨PVA溶液濃度的增加而提高,而黏度的高低會(huì)影響到BNC體積收縮和PVA的沉積過程因此,MBP管內(nèi)外表面的差異可能歸因于不同濃度PVA溶液的黏度差異。 


2 BNCMBNCMBP管的微觀形貌(FE-SEM):(A)內(nèi)表面;(B)外表面。


  由于PVA會(huì)在堿溶液中發(fā)生沉淀,因此PVABNC網(wǎng)絡(luò)中的沉積在一定程度上抑制了絲光化過程中BNC的體積收縮。所以,與MBNC相比,MBP管的體積收縮率更低(見圖3B)。樣品的持水量如圖3C所示,BNC的持水量為197.66 mL/g,遠(yuǎn)高于MBNCMBP,由于絲光處理和PVA的引入,MBNCMBP管持水能力下降


  與BNC相比,MBP管的軸向楊氏模量徑向拉伸強(qiáng)度和爆破壓力隨著PVA含量的增加而提高,但其數(shù)值仍低于MBNC管(見圖3D、圖3E和圖3H)。此外,3FBNCMBNCMBP管的應(yīng)力應(yīng)變曲線PVA的引入改變了其力學(xué)拉伸特性,并且MBP管也具有遠(yuǎn)高于BNCMBNC的縫合強(qiáng)力,并隨著PVA含量的增加而提高(圖3G,變得利于手術(shù)操作。


  樣品的表面孔隙率由于PVA的沉淀發(fā)生變化(圖3G),BNCMBNCMBP-10MBP-12.5MBP-15的表面孔隙率分別為18.88%5.54%16.16%13.16%11.34%,進(jìn)一步說明PVA在纖維中的沉淀抑制了BNC的絲光化進(jìn)程。 


3 BNCMBNCMBP管的物理化學(xué)性質(zhì):(A)傅里葉全反射紅外光譜;(B)體積收縮率;(C)持水量;(D)軸向楊氏模量;(E)徑向拉伸強(qiáng)度;(F)應(yīng)力-應(yīng)變曲線;(G)縫合強(qiáng)力;(H)爆破壓;(I)表面孔隙率。*代表0.01<p<0.05**代表p<0.01#代表無顯著性差異p>0.05


  該研究MBP管分別進(jìn)行了100次的循環(huán)應(yīng)力試驗(yàn)和循環(huán)蠕變-恢復(fù)試驗(yàn)以確定其徑向回彈性能,徑向回彈性能的測定數(shù)據(jù)可以代表MBP管承受反復(fù)壓縮時(shí)的回彈性能和耐久性能(圖4)。循環(huán)蠕變-恢復(fù)試驗(yàn)表明,MBP導(dǎo)管能夠承受嚴(yán)重壓縮,并快速恢復(fù)到其原始形狀,表明其具有良好的抗機(jī)械壓縮性和耐久性。應(yīng)力循環(huán)試驗(yàn)也證實(shí)了各樣品的循環(huán)應(yīng)變曲線具有一致性,沒有發(fā)生明顯的漂移。徑向回彈試驗(yàn)的高重復(fù)性表明,MBP管在施加外力的重復(fù)壓縮過程中,可以快速恢復(fù)其原始形狀 


MBP管的循環(huán)蠕變-恢復(fù)試驗(yàn):(A)力-應(yīng)變曲線和(B)應(yīng)變-時(shí)間曲線;(CMBP管的循環(huán)應(yīng)力保持試驗(yàn)(黑線:力-時(shí)間曲線紅線:應(yīng)變-時(shí)間曲線)。


體外生物相容性的評估


  圖5ABNCMBNCMBP管的BSA蛋白吸附量結(jié)果。BNC的蛋白吸附量最高,為59.53 μg/cm2MBNCMBP-10MBP-12.5MBP-15上的BSA吸附量分別為5.30 μg/cm221.68 μg/cm214.56 μg/cm25.31 μg/cm2,均顯著低于BNC的蛋白吸附量。根據(jù)ISO 10993-4:2002,血液接觸類醫(yī)療器械的溶血率應(yīng)低于5%。圖5B的溶血率結(jié)果顯示BNCMBNCMBP管的溶血率均低于0.25%,說明不會(huì)造成溶血,符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。


  圖5CBNCMBNCMBP管的血漿復(fù)鈣動(dòng)力曲線。MBNC管吸光度到達(dá)最大吸光度的時(shí)間比其他樣品更長,這表明MBNC具有最長的血漿復(fù)鈣時(shí)間。此外,BNCPVA膜和MBP導(dǎo)管的血漿復(fù)鈣動(dòng)力曲線沒有明顯的差異,說明其血漿復(fù)鈣時(shí)間相近,說明將PVA引入到BNC三維網(wǎng)絡(luò)中的絲光化過程不會(huì)進(jìn)一步激活血液的內(nèi)源性凝血過程。 


5 BNCMBNCMBP管的血液相容性:(A)蛋白吸附量;(B)溶血率;(C)血漿復(fù)鈣動(dòng)力曲線;(D)全血凝固時(shí)間。(PVA膜作為對照)**代表p<0.01


  全血凝固實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖5D所示,在全血凝固實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)PVAOD值高于BNCMBNCMBP,其原因可能在于BNC基人工血管表面的纖維和多孔結(jié)構(gòu)可能可以吸附更多的蛋白質(zhì)。此外,需要特別注意的是,在與血液接觸35分鐘內(nèi),MBNCMBP管在OD540的吸光度均高于BNC,表明在與血液接觸的一段時(shí)間內(nèi)MBNCMBP管上的血液比BNC管凝固得更慢。


  樣品的血小板粘附情況如圖6所示,本實(shí)驗(yàn)采用的富血小板血漿分離自兔動(dòng)脈血MBNC表面的血小板粘附量最少,PVA膜次之,而BNC則具有最多的血小板粘附量。對MBP管而言,MBP管管腔的血小板粘附量低于BNC,且隨著PVA溶液濃度的提高而下降,但其粘附量仍高于MBNCBNCMBNCMBP管內(nèi)表面的血小板粘附量數(shù)據(jù)與表面孔隙率數(shù)據(jù)相匹配,說明更加緊密的表面結(jié)構(gòu)和更低蛋白吸附水平可以顯著降低血小板的粘附量。 


6 BNCMBNCMBP管內(nèi)表面的血小板粘附量(PVA膜作為對照)


  根據(jù)ISO 10993-12:2021的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),采用共培養(yǎng)法所測定HUVECs細(xì)胞存活率來測定BNCMBNCMBP的細(xì)胞毒性。圖7A為共培養(yǎng)法所得HUVECs的細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率均高于80%無明顯細(xì)胞毒性。


  圖7BHUVECs在樣品內(nèi)表面的增殖情況。在5天的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),BNCMBNCMBP管和PVACCK-8測定值均有所提高,表明所有樣品都可以支持HUVECs的增殖。 


7 BNCMBNCMBP管的細(xì)胞相容性:(A)共培養(yǎng)法所得HUVECs的細(xì)胞存活率;(BHUVEC的在樣品內(nèi)表面的增殖情況。*代表0.01<p<0.05**代表p<0.01#代表無顯著性差異p>0.05


MBP管的體內(nèi)功效評估——SD大鼠腹主動(dòng)脈移植實(shí)驗(yàn)


  用MBP-12.5小徑管替換SD大鼠的部分腹主動(dòng)脈以詳細(xì)評估其體內(nèi)生物相容性。圖8ASD大鼠腹主動(dòng)脈移植實(shí)驗(yàn)的示意圖以及多普勒超聲圖像結(jié)果。其結(jié)果顯示,在植入1周、4周、8周、12周、16周、20周和32周這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),MBP-12.5管腔內(nèi)可以觀察到正常的血流信號,血流正常,表明MBP-12.5在腹主動(dòng)脈移植后保持了相對滿意的遠(yuǎn)期通暢率。


  在MBP-12.5替換腹主動(dòng)脈32周后,以SD大鼠的自體血管為對照用組織學(xué)染色和免疫熒光染色研究MBP-12.5的組織形成情況。圖8BMBP-12.5替換腹主動(dòng)脈32周的組織學(xué)染色和免疫熒光染色結(jié)果,其中自體血管的橫截面被稱為ControlMBP-12.5管中段的橫截面被稱為Cross sectionMBP-12.5管的軸向橫截面被稱為Axial sectionMBP管與自體血管吻合處的橫截面被稱為Anastomosis,以研究植入的效果(圖8B)。圖8B中的紅色熒光(CD31)為內(nèi)皮細(xì)胞,綠色熒光(α-SMA)為平滑肌細(xì)胞,藍(lán)色熒光(DAPI)為細(xì)胞核樣品中段橫截面(Cross section血管吻合處橫截面(Anastomosis樣品軸向橫截面(Axial section中均可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞的紅色熒光、平滑肌細(xì)胞的綠色熒光及細(xì)胞核的藍(lán)色熒光,表明MBP-12.5管腔的內(nèi)部形成了內(nèi)皮層,并且在內(nèi)皮層的下方有平滑肌細(xì)胞生成。ControlCD31的熒光比其他樣本中的熒光更亮、更清晰,這意味著MBP-12.5的管腔內(nèi)部雖然有內(nèi)皮層的再生,但是內(nèi)皮層的再生效果可能并沒有自體血管好。此外,組織學(xué)染色結(jié)果H&E以及Masson也與免疫熒光的結(jié)果相對應(yīng)。


  BNC的可控絲光化處理技術(shù)和PVA的冷凍相分離技術(shù),最終獲得絲光化BNC/PVA小口徑復(fù)合人工血管(MBP)。MBP管不僅彈性好,具有良好的抗機(jī)械壓縮性和耐久性,并且縫合強(qiáng)力有所提升,體外生物相容性良好。將MBP-12.5用于SD大鼠腹主動(dòng)脈替換32周后,其管腔內(nèi)部血流通暢并且其管腔內(nèi)壁形成了內(nèi)皮層和平滑肌層,具有較好的遠(yuǎn)期通暢率和組織相容性。 


AMBP-12.5的植入示意圖以及其植入后1-32周的多普勒彩超;(BMBP-12.5植入32周的免疫熒光染色結(jié)果、HE染色結(jié)果和Masson染色結(jié)果(每組黃色和紅色框內(nèi)的放大結(jié)果均在其下方顯示)


  論文第一作者為東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士生胡高銓,通訊作者為細(xì)菌納米纖維制造及復(fù)合技術(shù)科研基地的洪楓研究員。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金和東華大學(xué)博士研究生創(chuàng)新基金的資助。


  全文下載鏈接:https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.124221

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