重慶大學蔡開勇/馮茜 Adv. Mater.：一石二鳥策略修復椎間盤髓核
椎間盤退變（IVDD）的病理生理過程極其復雜，包括NP細胞凋亡、細胞外基質（ECM）惡化、各種炎性細胞因子的釋放、纖維環破裂，繼而椎間盤高度和運動性下降。同時，在IVDD過程中，IVD信號轉導的紊亂和活性氧（ROS）的積累會進一步促進NP細胞凋亡，從而加重IVDD。大量臨床研究表明，ECM中ROS的水平與IVDD的嚴重程度密切相關。ROS的過度積累會誘發過度的氧化應激和NP損傷，最終導致IVD基質的完整性受損。
鑒于此，重慶大學蔡開勇教授/馮茜副教授和華中科技大學李鋒教授等人設計了一種由HA-NCSN和Cu2+構成的水凝膠，其在低度Cu2+濃度下表現出快速凝膠化、方便的注射和自愈特性以及出色的抗氧化能力。值得注意的是凝膠化過程中Cu2+被迅速還原，水凝膠顏色變黑且表現出高效的光熱性能。一方面，HA-NCSN/Cu水凝膠在抑制TNFα介導的炎癥和氧化應激方面表現出顯著的功效，由于其ROS清除能力而增強了NP細胞的活性。另一方面，RNA測序（RNA-seq）分析表明，輕度PTT可以激活NP細胞的TGF-β/Smad通路，SMAD2/3的磷酸化證明了這一點，從而進一步促進ACAN和COL2的表達和分泌，這兩者都是髓核細胞外基質的主要成分。
該研究成果于近日以“A One-Stone-Two–Birds Strategy for Intervertebral Disc Repair: Constructing a Reductive Chelation Hydrogel to Mitigate Oxidative Stress and Promote Disc Matrix Reconstruction”為題發表在Advanced Materials。重慶大學生物工程學院蔡開勇教授/馮茜副教授，華中科技大學同濟醫院李峰教授，卡托維茲西里西亞大學Serda, Maciej教授為通訊作者。重慶大學碩士研究生卜鵬真，華中科技大學博士研究生彭仁鵬，南方醫科大學張家明副研究員為論文的共同第一作者。
方案1展示了HA-NCSN/Cu 水凝膠通過抗氧化和光熱療法修復IVDD。HA-NCSN與Cu2+交聯形成水凝膠。將HA-NCSN/Cu水凝膠注入髓核，消除過量的ROS，從而保護NP細胞免受氧化應激。同時，光熱激活刺激NP細胞的TGF-/Smad通路，通過促進ACAN和COL2的表達和分泌來加速受損ECM的修復，從而有效治療IVDD。
方案1. HA-NCSN/Cu 水凝膠抗氧化和光熱療法修復 IVDD示意圖
【HA-NCSN/Cu 水凝膠的制備】
圖1首先展示了不同銅離子濃度下HA-NCSN/Cu水凝膠的制備，發現隨著Cu2+濃度增加，水凝膠的交聯密度增強，微孔尺寸減小。掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）表明，水凝膠具有均勻的多孔結構，Cu2+均勻分布，并形成了2-4納米的納米顆粒簇。X射線光電子能譜（XPS）分析顯示，部分Cu2+在凝膠過程中被還原為Cu+，表明硫脲基團與Cu2+之間發生了強烈的配位反應。基于第一性原理的Bader電荷分析也表明，硫脲基團將部分電子轉移到Cu2+，從而降低其氧化態。
圖1. HA-NCSN/Cu水凝膠的制備
【HA-NCSN/Cu 水凝膠的特性】
圖2展示了了HA-NCSN/Cu水凝膠的流變學性質、抗氧化性能、光熱效應及其在IVDD治療中的潛力。結果表明，HA-NCSN/Cu水凝膠具備優異的剪切稀化、自愈性和抗疲勞性能，且表現出良好的注射性和機械強度，尤其是HA-NCSN/Cu3，具有類似人髓核的彈性模量。水凝膠的抗氧化能力可有效清除DPPH和OH·自由基，主要歸因于HA-NCSN聚合物。通過近紅外光照射，HA-NCSN/Cu水凝膠表現出極好的光熱效應，并具備可控性和可重復性。體內實驗表明，水凝膠在髓核組織內可通過外部近紅外光觸發加熱，為體內光熱治療提供了基礎。
圖2 HA-NCSN/Cu水凝膠的特性
【HA-NCSN/Cu水凝膠在炎癥環境下對NP細胞的保護作用】
圖3展示了水凝膠對NP細胞炎性的抑制作用。通過HA-NCSN/Cu3水凝膠進行體外和體內實驗，評估其對髓核細胞（NP細胞）的生物相容性和抗炎效果。CCK-8實驗結果表明，HA-NCSN/Cu水凝膠在近紅外（NIR）照射下不影響細胞活性和增殖。HA-NCSN/Cu水凝膠顯著抑制了TNFα誘導的炎癥反應，增強了膠原Ⅱ（Col2a1）和聚集蛋白（Acan）的基因表達，并降低了Mmp3和Mmp13的基因表達，顯示出有效的抗炎作用。與HA-NCSN/Cu組相比，HA-NCSN/Cu+NIR組顯示出更優的治療效果，表明其光熱性能對抑制炎癥、促進NP細胞活性及加速IVDD修復具有重要作用。
圖3. 體外 NP 細胞再生評估
【HA-NCSN/Cu水凝膠清除ROS對NP細胞的影響】
為了進一步探討HA-NCSN/Cu水凝膠抗氧化和光熱作用調節髓核細胞的機制，研究通過RNA-seq分析了不同處理組（TNFα、TNFα/HA-NCSN/Cu、TNFα/HA-NCSN/Cu+NIR）對髓核細胞的影響。結果顯示，TNFα處理上調了1546個基因，下調了1015個基因，而HA-NCSN/Cu處理則調節了553個基因的上調和582個基因的下調。KEGG分析揭示，PI3K-Akt、TNF和IL-17信號通路在TNFα/HA-NCSN/Cu組中發生顯著變化。進一步分析發現，HA-NCSN/Cu水凝膠通過調節谷胱甘肽代謝通路（GSH）抑制ROS生成，顯著提高了抗氧化因子Nrf2和Hmox1的表達，表明其具有抗氧化和清除ROS的作用，從而保護髓核細胞免受炎癥和氧化損傷。
圖 4. HA-NCSN/Cu 水凝膠抑制 TNFα 誘導的 氧化應激。
【HA-NCSN/Cu水凝膠通過光熱效果激活TGF-β信號通路影響髓核細胞】
進一步比較了TNFα/HA-NCSN/Cu組與TNFα/HA-NCSN/Cu+NIR組的轉錄組表達差異。結果顯示，NIR誘導了158個基因上調和181個基因下調。KEGG分析表明，TGF-β信號通路在TNFα/HA-NCSN/Cu+NIR組中顯著變化，GSEA分析也顯示所有差異表達基因（DEGs）顯著富集于TGF-β信號通路。熱圖分析揭示，NIR顯著影響了與TGF-β通路相關的基因表達，Smad家族蛋白在該通路中起核心作用。TGF-β信號通路對髓核退變（IVDD）具有保護作用，可促進基質合成、抑制基質降解和炎癥反應。Western blot結果顯示，NIR顯著上調了磷酸化Smad2（pSMAD2）和磷酸化Smad3（pSMAD3）的蛋白水平，表明TGF-β通路被激活。綜上所述，HA-NCSN/Cu水凝膠結合光熱治療（PTT）通過激活TGF-β/Smad信號通路，有助于抵抗TNFα誘導的炎癥損傷。
圖 5. RNA-seq 顯示 HA-NCSN/Cu/NIR 激活 TGF-β 信號通路。
【使用大鼠 IVD 模型進行體內評估】
圖6展示了用針刺誘導的SD大鼠IVDD模型評估HA-NCSN/Cu水凝膠在體內的治療效果。實驗分為四組：未針刺組（對照組）、針刺組、HA-NCSN/Cu水凝膠注射組和HA-NCSN/Cu水凝膠注射+NIR組。CT成像顯示，HA-NCSN/Cu和HA-NCSN/Cu+NIR組在術后8周的椎間盤高度指數（DHI%）顯著高于針刺組。組織學評估結果顯示，針刺組（組II）表現出嚴重的細胞浸潤和高度紊亂的盤結構，而HA-NCSN/Cu組和HA-NCSN/Cu+NIR組則顯示出較為完整的髓核和有序的纖維環組織。免疫組化結果也表明，HA-NCSN/Cu水凝膠顯著增加了COL2A1和ACAN的表達，并降低了MMP3和MMP13的表達，表明HA-NCSN/Cu水凝膠結合NIR可有效延緩IVDD進程并促進其再生。
圖 6. 使用大鼠IVD模型進行體內評估。
【小結】
本文開發了一種還原性交聯的HA-NCSN/Cu水凝膠，并探索了其對IVDD的治療效果。HA-NCSN/Cu的合成簡單高效，具有可注射性、自修復、ROS清除和光熱特性等特性。基于其抗氧化和光熱特性的協同作用，一石二鳥設計已成功證明用于逆轉NP細胞損傷。一方面，HA-NCSN優異的ROS清除能力緩解了炎癥微環境，并調節了NP細胞的ROS生成相關谷胱甘肽代謝信號通路。另一方面，PTT顯著上調NP 細胞COLL2和ACAN的表達，同時下調 MMP3和MMP13的表達。此外，輕度PTT還通過激活TGF-β/Smad信號通路增強了IVDD的ECM再生。體內實驗最終驗證了HA-NCSN/Cu通過協同處理實現了顯著的IVD再生。這些結果表明，基于HA-NCSN/Cu水凝膠的微創協同治療在逆轉IVDD方面具有巨大的治療潛力，其中輕度PTT可能為IVDD治療提供新的見解。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202411290
