炎癥性腸病（IBD）是一種慢性、復(fù)發(fā)性腸道炎癥性疾病，常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和便血，全球超過700萬人受此困擾。臨床治療主要通過抑制腸道炎癥來緩解疾病相關(guān)癥狀，然而傳統(tǒng)藥物常存在靶向不足、粘膜屏障滲透有限等缺點(diǎn)，長期使用具有嚴(yán)重的副作用。埃洛石納米管（HNTs）是礦物藥“赤石脂”的主要成分，可用于治療腹瀉、潰瘍和便血。口服益生菌療法通過調(diào)節(jié)微生物平衡和生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生而備受關(guān)注。然而，由于缺乏抗氧化劑，炎癥性腸道微環(huán)境易對(duì)益生菌造成氧化損傷。因此，開發(fā)同時(shí)包覆益生菌和抗氧化劑的新策略具有重要意義。
近日，暨南大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院劉明賢教授團(tuán)隊(duì)利用茶多酚 (EGCG) 良好的粘附性和金屬配位能力對(duì)HNTs進(jìn)行功能化(MPN@HNTs)，將其與海藻酸鈉溶液共混制備MHBSA水凝膠微球, 用于益生菌遞送和炎癥性腸病的靶向治療。該研究成果以“Orally administered hydrogel containing polyphenol@halloysite clay for probiotic delivery and treatment of inflammatory bowel disease”為題發(fā)表在Nano Today期刊上。暨南大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院博士生陳翔宇為該論文第一作者，劉明賢教授為唯一通訊作者。
圖1a 展示了MPN@HNTs的制備過程：在弱堿性條件下，將HNTs超聲分散在溶液中，依次添加 Fe3+ 和 EGCG溶液并劇烈攪拌，使金屬多酚網(wǎng)絡(luò) (MPN) 修飾到HNTs表面，合成 MPN@HNTs。通過TEM、SEM和元素能譜分析確定了MPN 成功負(fù)載在 HNTs 表面。HNTs表面涂覆 MPN 后，尺寸從388.9±4.5 nm 增加到 414.8±4.2 nm，Zeta電位從 -17.6±0.6 mV降為 -30±1.3 mV。紅外光譜和紫外可見光光譜證明了多酚和金屬離子之間的成功配位。
圖1. MPN@HNTs 的合成與表征。(a) 制備示意圖。(b) TEM 照片。(c) SEM 照片。(d) 元素能譜分析。(e) 粒度。(f) Zeta 電位。(g) FTIR 光譜。(h) UV-vis 光譜。(i) XPS全譜圖。(j) Fe 2p、k) C 1s、和l) O 1s的 XPS 譜圖。
圖2a 展示了MHBSA 水凝膠微球的制備過程：將MPN@HNTs和BL在海藻酸鈉溶液中混合，采用氣動(dòng)泵動(dòng)態(tài)擠出技術(shù)構(gòu)建海藻酸微球體系（MHBSA）。通過SEM觀察和元素能譜分析發(fā)現(xiàn)，MPN@HNTs在微球中均勻分布。MHBSA與IEC-6和RAW 264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞增殖不受影響，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。微球在模擬胃液中2h仍保持完整的球形結(jié)構(gòu)，但在模擬腸液中迅速溶脹，這一結(jié)果說明MHBSA微球能夠耐受酸性胃環(huán)境并能成功在腸道環(huán)境中釋放內(nèi)容物。與海藻酸鹽微球相比，在微球中添加MPN@HNTs后可明顯提高益生菌在模擬胃液中的存活率，在模擬胃液中孵育2h后存活率仍可達(dá)81.7%，這是由于MPN@HNTs填充在水凝膠孔隙中，有效阻止了有害物質(zhì)的進(jìn)入。
圖2. MHBSA微球的制備、表征及穩(wěn)定性測(cè)試。(a) 制備示意圖。(b) SEM 照片。(c) SEM放大照片。(d) 粒度分布。(e) 元素能譜分析。(f) 活/死染色熒光顯微鏡照片。(g) 在 模擬胃液和腸液中SGF 中浸泡 2 小時(shí)然后轉(zhuǎn)移到 SIF 的 MHBSA 微球的數(shù)字和熒光顯微鏡圖像。(h) 在 SGF 中孵育不同時(shí)間段后，商業(yè)益生菌、嵌入 MHBSA 和 BSA 的 BL 的存活率。
清除炎癥部位過量的ROS和促炎細(xì)胞因子是IBD治療的關(guān)鍵。圖3a顯示細(xì)胞攝取MPN@HNTs具有時(shí)間依賴性，這是MPN@HNTs在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功效的先決條件。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MPN@HNTs可以有效清除LPS誘導(dǎo)下細(xì)胞產(chǎn)生的ROS并降低細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）的表達(dá)。除LPS外，還采用H2O2處理細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型，50 μg mL-1 MPN@HNTs預(yù)處理可以減輕H2O2造成的氧化損傷，細(xì)胞活/死染色顯示PI陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞活力得以提升。此外，不同條件下的益生菌在模擬炎性結(jié)腸液中培養(yǎng)2小時(shí)后，平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示MPN@HNTs預(yù)處理可以提高益生菌的存活率。基于這些體外 ROS 清除、抗炎作用和生物相容性的結(jié)果，MPN@HNTs 被認(rèn)為在 IBD 治療中具有巨大的潛力。
圖3. 體外抗炎和抗氧化性能測(cè)試。(a) RAW 264.7對(duì)MPN@HNTs的攝取行為。(b) DCFH-DA染色的RAW 264.7的熒光照片。(c) 流式細(xì)胞技術(shù)分析。(d) 活/死染色照片。(e) 細(xì)胞活力檢測(cè)。(f) 平均熒光強(qiáng)度。(g-i) IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。(j) 不同處理后巨噬細(xì)胞的形態(tài)。 （k）菌落照片。（l）采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)菌量。（m）不同處理?xiàng)l件下BL的存活率。
IBD發(fā)病時(shí)，伴隨著腸內(nèi)容物浸潤到炎癥區(qū)域，大量陽離子蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗菌肽等）在結(jié)腸黏膜表面聚集。MHBSA微球在腸道環(huán)境中釋放MPN@HNTs和益生菌。MPN@HNTs的強(qiáng)負(fù)電荷和豐富的酚羥基驅(qū)使它們聚集在腸道炎癥部位（圖4）。體外模擬實(shí)驗(yàn)中，將健康和結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸段（1 cm）與MPN@HNTs在37°C下孵育，熒光成像照片顯示，炎癥結(jié)腸中滯留材料的熒光強(qiáng)度明顯高于健康結(jié)腸。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)給小鼠口服等量MHBSA，24 h后全腸道熒光成像照片和定量分析顯示，腸炎小鼠結(jié)腸組織中MPN@HNTs黏附和滯留較多。以上結(jié)果表明材料可通過延長胃腸道滯留時(shí)間，提高口服利用度，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)腸炎靶向治療。
圖4. 炎癥腸道粘附測(cè)試。(a) 結(jié)腸粘膜示意圖。(b) 遠(yuǎn)端結(jié)腸與MPN@HNTs在體外孵育后的熒光照片。(c) 口服MHBSA 24小時(shí)后，胃腸組織的熒光照片。(d) 結(jié)腸與MPN@HNTs在體外孵育后的總輻射效率。(e) 口服MHBSA 24小時(shí)后，結(jié)腸中的總輻射效率。(f) 口服MHBSA后，不同時(shí)間點(diǎn)胃腸道的熒光照片。(g) 使用IVIS成像系統(tǒng)量化的總輻射效率。
為了進(jìn)一步證明該策略的可行性，驗(yàn)證了MHBSA在DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎小鼠模型中的治療效果（圖5）。MHBSA可有效緩解結(jié)腸炎小鼠的一系列癥狀，包括體重降低、脾腫大、濕尾和便血現(xiàn)象。該材料的止血止瀉作用歸因于HNTs通過吸水濃縮血液、激活血小板和凝血途徑來止血。治療結(jié)束后收集各組小鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行組織學(xué)分析。蘇木精和伊紅染色結(jié)果顯示，DSS組結(jié)腸絨毛和隱窩結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，伴有大面積潰瘍和大量免疫細(xì)胞浸潤。相比之下，MHBSA治療組微絨毛完整，指狀隱窩結(jié)構(gòu)規(guī)則，炎癥細(xì)胞所占百分比低，形態(tài)接近對(duì)照組。MPN@HNTs表現(xiàn)出一定的治療效果，但效果未達(dá)到MHBSA的水平，該結(jié)果展示了MPN@HNTs在增強(qiáng)MHBSA對(duì)IBD治療效果方面的作用。
圖5. MHBSA微球?qū)?/span>DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎小鼠的治療效果。(a) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。(b) 小鼠體重每日變化。(c) DAI評(píng)分。(d) 濕尾和便血的代表性照片。(e) 治療后各組小鼠脾臟照片。(f) 治療后各組小鼠結(jié)腸照片。(g) 結(jié)腸組織H&E染色照片。(h) 便血指數(shù)。(i) 腹瀉指數(shù)。(j) 結(jié)腸長度量化。(k) 脾臟重量量化。(l) 組織學(xué)評(píng)分。
通過組織學(xué)分析，證明MHBSA可以有效修復(fù)腸道粘膜屏障（圖6）。Occludin和ZO-1是腸道中兩種主要的緊密連接蛋白，與腸道屏障的完整性直接相關(guān)。采用免疫熒光染色分析結(jié)腸組織中Occludin-1和ZO-1緊密連接蛋白的表達(dá)。健康組和MPN@HNTs和MHBSA治療組均觀察到明亮的紅色和綠色熒光，這表明不同治療均能不同程度地恢復(fù)緊密連接蛋白的表達(dá)。粘蛋白構(gòu)成腸道粘液層，由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，阻止有害物質(zhì)和病原體的進(jìn)入。阿利新藍(lán)-過碘酸雪夫染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和 MHBSA 處理組均出現(xiàn)豐富的杯狀細(xì)胞，且杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯高于 DSS 處理組。
圖6. MHBSA促進(jìn)組織修復(fù)。（a）Occludin 免疫熒光照片。（b）Occludin 的定量分析。（c）ZO-1 免疫熒光照片。（d）ZO-1 的定量分析。（e）AB-PAS 染色。（f）杯狀細(xì)胞所占面積分析。
通過多種炎癥指標(biāo)對(duì)治療效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，MHBSA可有效緩解DSS引起的結(jié)腸損傷和免疫反應(yīng)(圖7)。與模型組相比，MHBSA處理后減輕了氧化應(yīng)激引起的 DNA 損傷，表現(xiàn)為結(jié)腸炎癥部位的4-HNE（脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物）和 8-OHDG（DNA 損傷標(biāo)志物）的熒光強(qiáng)度減弱。進(jìn)一步研究了 MHBSA 對(duì)結(jié)腸炎小鼠的抗炎作用。MPN@HNTs和MHBSA治療后顯著抑制結(jié)腸組織中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示MHBSA抑制了DSS誘導(dǎo)的腸道組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)的上調(diào)，說明抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活可能是MHBSA發(fā)揮抗炎作用的藥理機(jī)制。
圖7. MHBSA 微球抑制腸道炎癥。（a-c）4-HNE 和 8-OHDG 的免疫熒光照片及定量分析。（d - g）炎癥因子的mRNA表達(dá)水平。（h）通過免疫印跡檢測(cè)TLR4、MyD88 和 NF-κB 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。（i - k）蛋白質(zhì)表達(dá)水平的定量分析。
為了探討MHBSA對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)控作用，利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)分析結(jié)腸炎小鼠糞便微生物的組成和豐度 (圖8)。微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（SCFAs）具有優(yōu)良的抗炎特性，在緩解免疫系統(tǒng)紊亂以及維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。MHBSA處理后可以增加產(chǎn)SCFAs有益菌（Lachnospiraceae和Firmicutes）的豐度。綜合分析不同生物水平上不同處理組的微生物組成，MHBSA治療組小鼠的腸道菌群更接近健康小鼠。綜上所述，MHBSA 通過調(diào)節(jié)腸道微生物群的組成，在IBD的治療中發(fā)揮了積極作用。
圖8. 腸道菌群 16S rRNA 測(cè)序分析。（a-c）Shannon 指數(shù)（a）、Simpon 指數(shù)（b）和 Chao1 指數(shù)（c）。（d）基于unweighted unifrac 距離矩陣熱圖的 ρ多樣性指數(shù)分析。（e）門水平腸道微生物相對(duì)豐度直方圖。（f）科水平不同物種相對(duì)豐度直方圖。（g）基于 metagenomeSeq 結(jié)果的目水平物種和組間功能差異熱圖。（h）KO 功能的相對(duì)豐度直方圖。（i）基于unweighted unifrac 距離的腸道菌群的主坐標(biāo)分析 (PCoA)。（j）基于 Bray-Curtis指標(biāo)的腸道菌群的主坐標(biāo)分析 (PCoA) 圖。（k）功能豐度聚類圖。
緩解炎癥、調(diào)節(jié)腸道菌群是治療IBD的關(guān)鍵，但單一組分藥物或益生菌的治療效果有限。受Smecta®、Hemospray等礦物藥的啟發(fā)，本研究成功構(gòu)建了含多酚修飾納米黏土埃洛石和益生菌的水凝膠微球體系，用于IBD的靶向治療。HNTs的強(qiáng)負(fù)電荷驅(qū)使MPN@HNTs靶向遞送到炎癥微環(huán)境并增強(qiáng)其在炎癥腸黏膜中的滯留時(shí)間，減少了脫靶引起的全身副作用。HNTs通過吸收出血部位的水分并和血液發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)止瀉止血。抗氧化防御系統(tǒng)與益生菌的結(jié)合增加了結(jié)腸炎小鼠中有益菌的豐度，協(xié)同發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群作用。因此，含有HNTs和益生菌的pH響應(yīng)性載藥系統(tǒng)為IBD的治療提供了新的方案。
該論文得到了國家自然科學(xué)基金（52073121）、佛山國家高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（2220197000129）項(xiàng)目和中央高校基礎(chǔ)研究基金（21624115）的資助。
論文鏈接：
https://authors.elsevier.com/c/1kdDa6DSyBLhtW
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1748013225000416
