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  骨缺損修復(fù)是臨床醫(yī)學(xué)中的重大挑戰(zhàn)，現(xiàn)有骨移植材料常面臨機(jī)械性能不足、操作不便、降解不可控及成骨活性有限等問(wèn)題。盡管羥基磷灰石、生物玻璃等無(wú)機(jī)材料在骨修復(fù)中廣泛應(yīng)用。通常，無(wú)機(jī)材料首先以粉末形式制備。然后，粉末通過(guò)燒結(jié)或通過(guò)耗時(shí)的水合過(guò)程，或通過(guò)分散在堅(jiān)韌的有機(jī)網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行固結(jié)。然而，天然骨組織的形成可以在溫和的生理?xiàng)l件形成。在骨組織生成過(guò)程中，無(wú)定形磷灰石顆粒在膠原蛋白和非膠原蛋白聚糖的介導(dǎo)下形成作為前驅(qū)體。然后，前驅(qū)體通過(guò)顆粒-顆粒融合產(chǎn)生骨架，從而實(shí)現(xiàn)了從無(wú)機(jī)顆粒構(gòu)建整體的骨骼。然而，現(xiàn)有的磷酸鈣顆粒難以用于實(shí)現(xiàn)仿天然骨骼的形成，其活性是限制整體組裝的關(guān)鍵因素之一。

  四川大學(xué)李旭東教授課題組長(zhǎng)期致力于研究多種天然物質(zhì)對(duì)無(wú)機(jī)晶體的結(jié)構(gòu)特性的影響和機(jī)制，以及材料的生物學(xué)效應(yīng)。例如，海藻酸鈉的仿生礦化體系調(diào)控合成納米針狀磷灰石（Langmuir 2018, 34, 6797-6805. Biomaterials Science 2020, 8, 19, 5390-5401. Cryst. Growth & Des. 2015, 15 ,4, 1949-1956.）、透明質(zhì)酸基受控礦化體系構(gòu)建多形貌的磷灰石顆粒（Carbohydrate Polymers. 2023, 322  121345. Chem. Commun. 2010, 46, 1278-1280. Front. Mater. Sci. 2012, 6, 4, 283-296. Adv. Appl. Ceram. 2016, 115, 1-5.）、纖維素控制針狀磷灰石構(gòu)建超薄納米帶（Inorg. Chem. 2018, 57, 4516-4523. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2013, 25, 7, 994-998.）、茶多酚對(duì)無(wú)機(jī)磷酸鈣和草酸鈣結(jié)晶的影響（J Biomed Mater Res Part B 2015, 103B, 1525-1531. Cryst Eng Comm 2010, 12, 845-852.）、透明質(zhì)酸調(diào)控形成頂狀不對(duì)稱方解石晶體（Cryst. Growth Des. 2010, 10.）、明膠調(diào)控形成單分散CaCO₃花瓣球形微粒（化學(xué)研究與應(yīng)用，2010, 22, 5, 574-578.）、以及多組分協(xié)同構(gòu)建無(wú)機(jī)復(fù)合顆粒（J. Mater. Sci. Mater. Med. 2010, 21, 2561-2568.）。由于有機(jī)分子對(duì)無(wú)機(jī)晶體結(jié)晶的調(diào)控，無(wú)機(jī)晶體粒子展現(xiàn)出不同的多級(jí)結(jié)構(gòu)形貌（圖1）。

圖1. （A）海藻酸鈉介導(dǎo)的納米磷酸鈣針狀晶體。（B）透明質(zhì)酸協(xié)同受限擴(kuò)散體系構(gòu)建的磷酸鈣花球晶體。（C）纖維素調(diào)控的磷酸鈣超薄納米帶。（D）明膠介導(dǎo)的頂狀不對(duì)稱方解石晶體。

  在無(wú)機(jī)晶體的結(jié)晶過(guò)程中，有機(jī)分子不僅調(diào)控了無(wú)機(jī)晶體的形貌，而且還與晶體有效結(jié)合，從而構(gòu)建為無(wú)機(jī)-有機(jī)雜化體。由于有機(jī)分子的引入，無(wú)機(jī)-有機(jī)雜化體可以實(shí)現(xiàn)更為豐富的化學(xué)改性修飾。李教授課題組基于海藻酸鈉的仿生礦化體系，構(gòu)建了海藻酸鈉-羥基磷灰石雜化粒子。通過(guò)進(jìn)一步的氧化處理，獲得了醛基改性的雜化粒子（OAPs）。通過(guò)紅外光譜、XRD圖譜和熱重圖譜，證明獲得的粒子為具有類骨特征的醛基化海藻酸鈉-羥基磷灰石復(fù)合粒子。以上結(jié)果表明，這種新型的無(wú)機(jī)材料的構(gòu)建策略可以有效改善傳統(tǒng)無(wú)機(jī)物改性困難的問(wèn)題，為新型無(wú)機(jī)材料的構(gòu)建提供的新的見(jiàn)解。

圖2. 改性海藻酸鈉-羥基磷灰石雜化粒子的（A）XRD和（B）紅外圖譜。（C）不同氧化時(shí)間和（D）不同海藻酸鈉含量的OAPs的熱重圖譜。

  基于這種新型的具有化學(xué)活性的磷灰石，李教授課題組開(kāi)發(fā)了新型的骨修復(fù)材料：

  （一）、具有可調(diào)模量和應(yīng)力松弛性能的膠原纖維基質(zhì)：化學(xué)活性磷灰石的雙重增強(qiáng)效應(yīng)（Collagen fibrillar matrices with tunable modulus and stress relaxation: Alginate-activated organoapatite nanoparticles yield dual reinforcement effects. Chemical Engineering Journal. 2025, 517, 164591.）

  將化學(xué)活性磷灰石引入膠原蛋白基質(zhì)中，構(gòu)建了新型的膠原蛋白/磷灰石 （CA）基質(zhì)。通過(guò)OAPs的醛基與膠原蛋白的氨基之間席夫堿交聯(lián)以及物理釘扎效應(yīng)，從而增強(qiáng)了膠原蛋白基質(zhì)的力學(xué)性能。如圖3所示，OAPs的引入，CA基質(zhì)展現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的模量和應(yīng)力松弛性能。此外，CA基質(zhì)的力學(xué)性能與OAPs的海藻酸鈉含量和醛基含量呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。由此可見(jiàn)，OAPs通過(guò)物理和化學(xué)雙重效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)膠原基質(zhì)的力學(xué)性能的增強(qiáng)。

圖3. 改性海藻酸鈉-羥基磷灰石雜化粒子增強(qiáng)的膠原仿生基質(zhì)的流變學(xué)性質(zhì)（模量和應(yīng)力松弛性能）。

  流變學(xué)結(jié)果表明CAs基質(zhì)在宏觀尺度下具有類似于天然組織的粘彈性。然而，細(xì)胞對(duì)基質(zhì)特性的感知和反應(yīng)往往是在微/納米尺度上進(jìn)行的。因此，采用納米壓痕儀探究了CAs基質(zhì)在微觀尺度下的力學(xué)特性。如圖4所示，純膠原基質(zhì)的載荷-壓痕曲線展現(xiàn)出典型的非線性響應(yīng)特征，加載和卸載過(guò)程存在明顯的遲滯現(xiàn)象，證明了其粘彈性和非線性彈性網(wǎng)絡(luò)。這種應(yīng)力遲滯現(xiàn)象可能是由于纖維網(wǎng)絡(luò)的滑移和重新排列造成的。此外，多點(diǎn)模量掃描結(jié)果表明，OAPs可以增強(qiáng)CAs基質(zhì)在微/納米尺度下的模量和應(yīng)力松弛性能。

圖4. 改性海藻酸鈉-羥基磷灰石雜化粒子增強(qiáng)的膠原仿生基質(zhì)的微/納米尺度下的力學(xué)性質(zhì)。

  通過(guò)激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察了MSCs在CAs基質(zhì)上培養(yǎng)4天后的鋪展形態(tài)。其中F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架采用TRITC-鬼筆環(huán)肽進(jìn)行熒光標(biāo)記，細(xì)胞核采用DAPI染色。如圖5A所示，在所有基質(zhì)上，MSCs細(xì)胞表面延伸出大量偽足，表明MSCs能夠在CAs基質(zhì)上良好粘附和生長(zhǎng)。純膠原基質(zhì)上的MSCs細(xì)胞呈現(xiàn)典型的多邊形立方體形態(tài)。在CA2和CA4基質(zhì)上，MSCs形態(tài)趨于細(xì)長(zhǎng)的紡錘形，并伴隨有長(zhǎng)絲狀偽足的延伸。這種形態(tài)改變可能與MSCs的成骨分化進(jìn)程相關(guān)。而在含有最多OAP的CA6基質(zhì)中，MSCs呈現(xiàn)多邊形與紡錘形共存的異質(zhì)的形態(tài)特征，這可能與CA6結(jié)構(gòu)上的不均一性有關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)CAs基質(zhì)能夠?yàn)?/span>MSCs的生長(zhǎng)提供適宜的微環(huán)境。

  通過(guò)qPCR進(jìn)一步研究了MSCs在CAs基質(zhì)上的成骨相關(guān)基因表達(dá)。如圖5B-C所示，相比于純膠原組，CA2組中BMP的表達(dá)略微升高2.4倍。當(dāng)進(jìn)一步增加OAPs含量，CA4組中BMP的表達(dá)顯著上調(diào)，比純膠原組高33倍。然而，相比于CA4組，CA6組中BMP的表達(dá)有所下降，但仍比Col組高8倍。這種上調(diào)可能是由于CA4具有高的基質(zhì)模量、快速應(yīng)力松弛行為以及羥基磷灰石的共同作用[167]。此外，OCN和OPN的表達(dá)呈現(xiàn)與OAPs的濃度正相關(guān)的趨勢(shì)（圖2.16B和C）。CA4和CA6組中OCN和OPN的表達(dá)明顯高于其他兩組。此外，相比于商用的羥基磷灰石及其制備的膠原復(fù)合基質(zhì)，OAPs和CAs展現(xiàn)出更加優(yōu)異的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力。

圖5. （A）在 CAs 基質(zhì)上培養(yǎng) 4 天的 MSC 的細(xì)胞鋪展形態(tài)。在具有不同 OAPs 含量的 （B） CA 基質(zhì)上培養(yǎng)的 MSCs 的成骨基因表達(dá)，（C）和商業(yè)羥基磷灰石（HAP）、OAP、膠原蛋白/HAP（CH4）和 CA4 基質(zhì)。

  （二）、化學(xué)活性磷灰石構(gòu)建的具有多級(jí)適配性的新型骨修復(fù)材料（Multilevel Adaptive Monolithic Bone Mimics from Self-Bondable Organoapatite. Composites Part B: Engineering. 2025, 296, 112271.）

  羥基磷灰石、生物活性玻璃和硫酸鈣等無(wú)機(jī)材料已被廣泛應(yīng)用于骨缺損治療。傳統(tǒng)無(wú)機(jī)塊體的制備方法通常先將無(wú)機(jī)材料制成粉末，再通過(guò)燒結(jié)、水化反應(yīng)或分散于有機(jī)網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行固化。然而，受限于復(fù)雜的制備流程以及材料性能的不足，新型的制備手段亟待進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。近年來(lái)，3D打印技術(shù)憑借其可控性以及優(yōu)異的個(gè)性化適配性，在構(gòu)建各種類型的材料方面被廣泛的研究和應(yīng)用。盡管以上方法已實(shí)現(xiàn)無(wú)機(jī)骨修復(fù)材料的構(gòu)建，但面對(duì)骨組織工程日益增長(zhǎng)的需求，開(kāi)發(fā)具有優(yōu)異性能的新型無(wú)機(jī)材料制備策略仍十分必要的。值得注意的是，在生物體內(nèi)的礦化過(guò)程中，礦物質(zhì)融合形成骨基質(zhì)往往不需要極端的條件，其在生理?xiàng)l件下就可以高效進(jìn)行，這與現(xiàn)行無(wú)機(jī)粉末構(gòu)建無(wú)機(jī)塊體的加工技術(shù)形成鮮明對(duì)比。在骨形成過(guò)程中，無(wú)定形磷灰石前體顆粒首先在膠原蛋白和非膠原蛋白聚糖介導(dǎo)下形成。然后，通過(guò)無(wú)定形磷灰石前體顆粒的融合實(shí)現(xiàn)整體骨基質(zhì)的構(gòu)建。

  在本研究中，李教授課題組將具有OAPs與羧甲基殼聚糖（CMCS）結(jié)合構(gòu)建了一種新型的骨修復(fù)材料（BM）。如圖6和視頻1所示，BM可以在OAPs和CMCS混合后，再以注射或涂抹的方式到達(dá)缺損部位。然后、經(jīng)過(guò)溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，最終無(wú)縫地填充各種復(fù)雜、不規(guī)則的缺損。OAPs可以輕松與CMCS溶液混合形成前驅(qū)體。此時(shí)，前驅(qū)體具有優(yōu)秀的流動(dòng)性，可以涂抹或注射進(jìn)入不規(guī)則的形狀中，精確地貼合任何精細(xì)的幾何形狀。由于BM具有優(yōu)異的成型性，其可以實(shí)現(xiàn)從毫米級(jí)到米級(jí)的不同尺度形狀的構(gòu)建。BM不但可以完美模仿形狀的大致形貌，而且還可以對(duì)其中的多細(xì)節(jié)的完美復(fù)刻。因此，BM可以實(shí)現(xiàn)對(duì)骨組織工程中不同的缺損進(jìn)行合適填充。此外，他們?cè)诠趋郎蠘?gòu)建了不規(guī)則缺損，進(jìn)一步實(shí)際研究BM對(duì)缺損的填充作用。如圖所示，結(jié)果表明，BM能夠有效地填充不規(guī)則缺損并恢復(fù)骨完整性，在骨組織工程領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力。此外，得益于席夫堿反應(yīng)的可逆性，BM還具有自愈合能力。將斷開(kāi)的BM拼接在一起后，其能夠重新整合成一個(gè)整體。

圖6. （A）BM的操作性、可注射性和形狀適應(yīng)性的示意圖。（B）BM操作及使用方法的圖片。（C）基于BM，構(gòu)建的不同尺寸的精細(xì)形狀材料的數(shù)碼圖片。（D）BM填充骨缺損的數(shù)碼照片。（E）BM的自愈性圖像和（F）示意圖。

  骨骼在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要支撐作用，其維持著生物體的穩(wěn)定。機(jī)械支撐對(duì)治療骨缺損的骨科材料至關(guān)重要，其中抗壓強(qiáng)度是關(guān)鍵參數(shù)之一。因此，我們采用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)研究了BM的抗壓性能。如圖7所示，在0 – 20 %，BM-31展現(xiàn)出彈性形變過(guò)程，應(yīng)力-應(yīng)變呈線性相關(guān)的關(guān)系。當(dāng)應(yīng)變到達(dá)21.2 %時(shí)，應(yīng)力到達(dá)最大值后迅速下降，表明材料發(fā)生破損失效。對(duì)于BM-32和BM-33，應(yīng)力-應(yīng)變曲線與BM-31相似。此外，我們對(duì)不同BM的抗壓強(qiáng)度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。BM-31的抗壓強(qiáng)度約為0.61 MPa。 隨著OAP-3含量的增加，BM-32的抗壓強(qiáng)度提升至1.01 MPa。 值得注意的是當(dāng)進(jìn)一步增加OAP-3的含量，BM-33展現(xiàn)出出色的抗壓強(qiáng)度，可以達(dá)到2.15 MPa。這已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出傳統(tǒng)可注射氧化海藻酸鈉水凝膠的強(qiáng)度，已經(jīng)接近磷酸鈣骨水泥的性能。 此外，BM的彈性模量也與OAP-3含量呈正相關(guān)的關(guān)系。其中，BM-33的彈性模量約為10.19 MPa。

圖7. （A）BM-31, （B）BM-32 and（C） BM-33 （Φ = 6 mm, h=12 mm）的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，及（D）抗壓強(qiáng)度和（E）彈性模量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

  為了進(jìn)一步研究與成骨相關(guān)的基因表達(dá)的變化，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組 mRNA 測(cè)序分析。如圖8所示，與對(duì)照組相比，BM 表現(xiàn)出 1094 個(gè)基因的顯著上調(diào)和 1048 個(gè)基因的下調(diào)。基因表達(dá)熱圖顯示，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化相關(guān)關(guān)進(jìn)基因表達(dá)的增強(qiáng)，例如Tnn、Tgfa、Fgf1、Vegfc、Wnt5a、Bmp2、Il20rb 和 Fosl1。KEGG 富集分析表明 Wnt 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路和 JAK-STAT 信號(hào)通路的富集，表明 BM 在促進(jìn) MSCs 成骨分化的潛力。此外，生物過(guò)程的 GO 富集分析顯示細(xì)胞粘附、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子產(chǎn)生和血管發(fā)育相關(guān)生物過(guò)程的分析。此外，BM可以調(diào)節(jié)細(xì)胞成分和分子功能，包括“受體復(fù)合物、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞表面、細(xì)胞因子活性、抗氧化活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合和細(xì)胞因子受體結(jié)合”，從而介導(dǎo) MSC 的成骨分化。以上結(jié)果證明，BM 可以促進(jìn)成骨分化的基因表達(dá)和信號(hào)通路，從而可能促進(jìn)骨骼的形成和重建。

圖8. （A） 主成分分析。（B） 總差異基因的維恩圖。（C） 差異表達(dá)基因的火山圖。（D） 成骨細(xì)胞分化和 （E） 破骨細(xì)胞分化相關(guān)的差異表達(dá)基因的熱圖分析。（F） KEGG 和 （G） 信號(hào)通路的 GO 富集分析。

  通過(guò)大鼠顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證BM的骨修復(fù)能力。如圖9所示，BM可以有效促進(jìn)顱骨缺損的修復(fù)。此外，不同交聯(lián)度的BM展現(xiàn)出不同的體內(nèi)降解性，表明BM具有實(shí)現(xiàn)“降解-再生”匹配的潛力。H&E染色分析進(jìn)一步確認(rèn)了新生骨組織的形成。免疫組化和免疫熒光染色分析表明，BM可以有效提升RUNX2、OPN、OCN、ALP和OST的表達(dá)，從而促進(jìn)新生骨組織的形成。

圖9.顱骨缺損 （5 mm）修復(fù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。（A） 顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)的示意圖和實(shí)驗(yàn)安排表。（B）手術(shù)后 4 、 8 和 16 周顱骨的 micro-CT 圖像。比例尺為 1.5 毫米。（C） 脫鈣切片的 H&E 染色。比例尺為 1 mm 和 200 μm。脫鈣顱骨切片的（D， G） RUNX2、（E， H） OPN 和 （F， I） OCN 的免疫組織化學(xué)染色和定量分析。

  采用臨界顱骨缺損（8 mm） 以進(jìn)一步研究 BM-33 在體內(nèi)的長(zhǎng)期效果。通過(guò)連續(xù)的顯微 CT 監(jiān)測(cè)用相同樣本的顱骨缺損修復(fù)進(jìn)程和材料的降解情況。如圖10所示，對(duì)照組隨時(shí)間沒(méi)有明顯變化。在前三個(gè)月，BM-33組顱骨和材料幾乎沒(méi)有變化。第4個(gè)月時(shí)，BM 的邊緣開(kāi)始輕微降解，伴隨著 BM-33材料表面出現(xiàn)高密度物質(zhì)。第8個(gè)月時(shí)，高密度新生骨組織幾乎完全覆蓋了材料。H&E染色進(jìn)一步確認(rèn)了新生骨組織的形成。通過(guò)TRAP染色進(jìn)一步分析破骨細(xì)胞活性在骨再生過(guò)程中的表現(xiàn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，對(duì)照組均見(jiàn)明顯的TRAP活性，表明未發(fā)生破骨活性。對(duì)于BM-33，第4個(gè)月時(shí)同樣未見(jiàn)破骨細(xì)胞活性。第8個(gè)月時(shí)，材料與組織接觸的部位出現(xiàn)明顯的TRAP陽(yáng)性，表明此時(shí)破骨細(xì)胞活性增高。這可能與BM-33在不同階段的降解情況有關(guān)。前4個(gè)月材料處于與宿主組織融合階段，降解速率較緩，未能引發(fā)破骨細(xì)胞響應(yīng)。隨著材料與組織融合降解，從而促進(jìn)破骨活性的產(chǎn)生。此外，破骨活性的不同與新生骨形成進(jìn)程具有相關(guān)性。在實(shí)驗(yàn)后期，材料降解后，通過(guò)激活破骨細(xì)胞活性進(jìn)而啟動(dòng)“破骨-成骨”偶聯(lián)，從而促進(jìn)了骨修復(fù)，這與后期新骨的大量形成的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象一致。

圖10. 臨界顱骨缺損 （8 mm） 修復(fù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。（A）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的示意圖。（B） 術(shù)后 1、2、3、4、5、6、7 和 8 個(gè)月顱骨的顯微 CT 圖像。比例尺為 1 mm。HB 表示宿主骨。NB 表示新骨。FT 表示纖維組織。M 表示 BM-33 的材料。（C）未脫鈣切片的 H&E 染色和（D）顱骨的 TRAP 染色。黑色和紅色比例尺分別為 1 mm 和 0.5 mm。（E） BM 通過(guò)上調(diào)成骨相關(guān)因子的表達(dá)來(lái)形成成骨能力。

  原文鏈接：

  https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1385894725054270

  https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1359836825001611