益生菌和病原體的鑒別對人體健康有著非常重要的意義，具有高度特異性（包括菌株特異性）的微生物靶向療法因而也獲得了很大的關注。
蘇州大學陳高健教授、陳紅教授以及英國華威大學 David M. Haddleton 教授等同合作者們利用大腸桿菌 MG1655 菌株作為活性模板，原位合成了一種具有高度選擇性的含糖聚合物。通過這種細菌-糖單體-適配聚合 (BS-MAP) 的方法，研究人員們在細菌表面上得到了可以識別兩種不同大腸桿菌菌株的含糖聚合物，并通過細菌聚集實驗和 QCM-D 測量證實了這種含糖聚合物的特異性細菌結合能力。此外，這種含糖聚合物還表現出較強的抑菌能力，還可以防止細菌在共培養試驗中傷害正常細胞。
相關工作以前沿論文 (Edge article) 發表在英國皇家化學會旗艦期刊 Chemical Science 上并入選 2019 Chemical Science HOT Article Collection。
研究背景
益生菌可保護宿主免受外界環境的侵害，而致病菌可能會引起傳染病？股赝ㄟ^殺滅病原體來治療細菌感染，但它們也可能殺滅非病原體，從而改變微生物群的組成并增加對繼發感染的易感性。另外，細菌菌株與細菌種類一樣重要，因為微小的突變可能將益生菌轉化為相同種類的致病菌，一些非致命微生物甚至可能因此變得致命。因此，開發微生物靶向性的抗菌療法就變得至關重要；這種藥劑應具有高度的特異性，包括對菌株的特異性。
菌株 (strain) 也稱品系，是指同種細菌中不同來源的純培養物。具有典型特征的菌株稱為典型株或代表株或標準株。不同菌株可能性狀完全相同，也可能有某種微小差異。
在不同的選擇性試劑中，糖類在涉及信號識別和信號傳導的生物過程中起著重要的作用。一些糖對蛋白質具有高親和力，使其在特異性方面展現出巨大優勢，因此人工合成的含糖聚合物能表現出很強的選擇性。然而，如何獲得在菌株水平上識別特定細菌的含糖聚合物仍需探索，而這樣的工作還尚未有報道。
本篇論文
本文作者選擇了合適的糖單體和聚合方法，以細菌為「活」模板，通過糖序列的優化排列，原位合成了能實現菌株特異性親和的含糖聚合物。這種方法被稱為細菌-糖單體-適配聚合法 (bacteria-sugar monomer-aptation-polymerization, BS-MAP)。
鑒于大腸桿菌的基因型多樣性和操作便捷性，本文作者選擇大腸桿菌為模型細菌。所用的兩種單體是 MAG 和 MEDSA。
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MAG 是具有細菌結合能力的含糖單體；
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MEDSA 是不含糖的非結合單體，可以作為聚合物鏈中的間隔分子。
得益于大腸桿菌的還原性，這些單體以再生電子轉移催化 (activator regenerated electron transfer, ARGET) 機制進行原子轉移自由基聚合 (atom transfer radical polymerization, ATRP)，得到兩種聚合物：
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直接從溶液中獲得的聚合物（SP，可理解為 solution polymer)；
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向體系中加入甘露糖 (mannose) 后從細菌表面上洗脫獲得的聚合物（BP，可理解為 bacteria polymer）。
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細菌存在下的聚合過程示意圖，可以獲得兩種不同的聚合物 SP 和 BP。 |
本文作者還在沒有模版細菌存在的情況下進行自由基聚合，制備出了非模板化的聚合物 (non-templated polymer, NP)，以便與 SP 和 BP 進行對比。SP 和 NP 中的糖含量都約為 30%，BP 中的糖含量則高達約 50%。此外，本文作者還根據 BP 中的 MAG 和 MEDSA 含量，制備得到了和 BP 具有相同單體組成比例的聚合物 RP（可理解為「隨機聚合」Random Polymerization）。
細菌聚集試驗和 QCM-D 測試證明了 BP 聚合物對細菌菌株的特異性，并且產生特異性的主要因素不是含糖聚合物中的糖含量以及 MAG 和 MEDSA 的比例，而是鏈的序列。通過 BS-MAP 可以方便地獲得具有優化的糖含量和鏈序列的含糖聚合物。共培養試驗表明 BP 聚合物是細菌粘附的潛在抑制劑，也是內皮細胞在金底物上附著和增殖的促進劑。
該方法為人工合成的含糖聚合物的制備提供了一種方便和通用的策略，所報道的含糖聚合物對用作合成模板的細菌具有高度的特異性。該技術有望成為許多應用的基礎，例如細胞和微生物的標記和捕獲等。本文入選 2019 Chemical Science HOT Article Collection。蘇州大學博士研究生羅妍為本論文的第一作者，David M. Haddleton 教授、陳高健教授、陳紅教授為本論文的共同通訊作者。
圖文解讀
本文作者首先使用細菌聚集實驗來研究 BP 是否可以按預期與模板細菌進行特異性的結合。除上述三種共聚物外，還合成 MAG 和 MEDSA 的均聚物 pMAG 和 pMEDSA 作為對照。為了測試聚合物的特異性，選擇了大腸桿菌菌株 DH5α (E. coli DH5α) 作為非模板細菌，其衍生自模板菌株大腸桿菌菌株 MG1655 (E. coli MG1655)，只是基因組略有改變（屬于不同的菌株）。
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圖 1. (A) 聚合物 NP、SP、RP、BP 引起的模板菌株 E. coli MG1655 和非模板菌株 E. coli DH5α 的聚集，兩種菌株均用 STYO9（綠色）染色。 如 (A) 所示，在各聚合物中，以 E. coli MG1655 為模板得到的 BP 聚集 MG1655 的能力最強。pMEDSA 引起的 MG1655 聚集非常少，可能是由于其作為兩性離子可抑制細菌的靠攏；pMAG 引起 MG1655 的部分聚集，但程度遠低于 BP，表明較高的糖含量未必會獲得更高的親和力。NP 和 SP 引起少量的 MG1655 聚集，但程度小于 BP 和均聚物 pMAG。除了 BP 外，其它聚合物聚集非模板菌株 DH5α 的能力與它們對模板菌株 MG1655 的聚集能力類似。與 MG 1655 在 BP 溶液中的情況相比，BP 溶液中 DH5α 聚集簇的數量顯著減少，甚至低于 NP 中的結果。 |
上述結果表明，從模板菌株 E. coli MG1655 表面獲得的 BP 聚合物具有菌株特異性的親和力。對于涉及到復雜體系的「真實世界」，希望 BP 可以在兩種或更多種細菌組成的菌群中特異性地識別靶標。因此，本文作者接下來測試的是 BP 在由模版菌和非模版菌組成的混合物中識別模版菌的能力。
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圖 1. (B) 聚合物 NP、SP、RP、BP 引起的模板菌和非模板菌混合物中的分離和聚集狀態；模板菌株用 STYO9（綠色）染色，非模板菌株用表達紅色熒光蛋白的靶基因修飾。 如 (B) 所示，在 NP 和 SP 的溶液中出現了一些細菌的聚集，紅色和綠色的熒光都有被觀察到，表明這兩種聚合物與細菌的結合較弱，且是非特異性的。RP 的情況下兩種細菌都只有部分聚集。對照明顯的是，在 BP 溶液中，觀察到大的綠色簇但未觀察到紅色簇，進一步證實 BP 在模版菌與非模板細菌的混合物中具有對模板菌株 MG1655 具有特異性的親和力。 |
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圖 2. (A) 共聚物 RP、NP、SP、BP 的 13C-NMR 表征，核磁碳譜峰的典型差異。 如圖所示，在 –CH?– 碳的化學位移區域 (58 – 61 ppm)，所有的其它共聚物都在 60.5 至 60.8 ppm 附近顯示出兩個寬峰，而只有共聚物 BP 顯示出兩個尖峰，它們被確定為 MAG 和 MEDSA 單體 –CH?–O– 上兩處化學環境不同的碳。 |
上述結果表明上述含糖聚合物的鏈序列不同，這也解釋了它們的特異性與結合能力差異。受限于現有的分析方法，BP精確的單體序列目前還無法確定。
接下來，本文作者還通過耗散型石英晶體微天平 (Quartz Crystal Microbalance with Dissipation, QCM-D) 測量和金納米顆粒 (gold nano-particles, GNPs) 對含糖聚合物進行進一步的細菌結合能力評價。其中，QCM-D 是基于石英的壓電特性制備的一種表面敏感型分析技術，能感應到納克級的質量變化，可以用于微生物吸附行為的研究。
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圖 S14. 細菌層分別與聚合物 NP、SP、BP 溶液接觸情況下，QCM-D 頻率隨時間的變化：(A) 模板菌株 E. coli MG1655 和 (B) 非模板菌株 E. coli DH5α。(C) 為與聚合物 NP、SP、BP 溶液接觸后模版菌與非模板細菌層 QCM-D 頻率變化平均值。 如 (A) 所示，BP 對模板菌株 E. coli MG1655 的吸附是各聚合物中最高的，與細菌聚集實驗的結果一致。如 (B) 所示，在非模板細菌株 DH5α 中，由 NP 和 SP 引起的頻率變化與模板菌類似。然而，DH5α 對 BP 相對于 MG1655對BP 有著顯著的差異：首先是頻率快速降低，注入水后頻率又迅速增加，表明 BP 與非模板菌之間的相互作用很弱（被水輕易洗脫）。(C) 中給出的比較結果表明，BP 對模板菌的頻率變化大約是非模板菌的 47 倍，BP 對模板菌的特異性非常明顯。 |
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圖 3. (A) 用含糖聚合物 SP 和 BP 修飾金納米顆粒 (gold nano-particles, GNPs) 的過程示意圖。(B) 修飾后的 GNPs 和模板菌 MG1655 之間的相互作用。 如圖所示，SP 修飾的 GNP 在細菌周圍隨機分布，只有少數粘附到細菌上。相反，BP 修飾的 GNP 則大量出現在細菌表面附近，表明了 BP 和 MG1655 之間的特異性親和力。 |
在上述實驗數據成功地展示出 BP 特異性結合模版菌的特性后，本文作者接下來對 BP 作為抗感染劑的可能性進行了初步研究。作者推測 BP 會占據特定細菌的結合位點，從而阻止或削弱細菌與細胞的相互作用。本文所進行的試驗以內皮細胞 (endothelial cells, ECs) 為模型：紡錘形細胞形態表明細胞功能較為健康，圓形細胞形態表明細胞活性較低。
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圖 4. 含糖聚合物 BP、SP、NP 在抗感染實驗中的抑菌作用。(A) 與細菌和不同聚合物孵育 12 小時后 ECs 的圖像：(1) 不含聚合物／空白；(2) 加入 BP；(3) 加入 SP；(4) 加入 NP。(B) 暴露于不同聚合物后，紡錘形 ECs 的百分比。 如圖所示，在暴露于細菌后，依然保持活性的 EC 細胞不到 20%。SP 和 NP 的引入改善了細胞活性率至約 50％，而在引入 BP 時幾乎所有細胞都呈活性較好的紡錘形？梢娺@些含糖聚合物可以抑制 MG1655 菌對正常細胞的傷害，而對 MG1655 具有最高親和力的 BP 正是最有效的抗菌劑。 |
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圖 5. BP 在金表面共培養實驗中的抑制作用 (C + B: cells + bacteria)。EC 細胞核用 DAPI（藍色）染色，F-肌動蛋白用 FITC（綠色）染色。(A) 金表面上不存在（C + B，左側）與存在（C + B + BP，右側）含糖聚合物 BP 的情況。(B) C + B 和 C + B + BP 情況下金表面上的 ECs密度。 如圖 (A) 所示，ECs 未能有效地與 MG1655 競爭，金表面幾乎未觀察到細胞，僅有的少數綠點可能是細胞的殘片。該結果表明 MG1655 細菌抑制了 EC 細胞的生長，甚至導致其死亡。當存在 BP 時，可見 EC 細胞呈紡錘形，看起來更為健康。由 (B) 可知，BP 組中的細胞密度比無 BP組高 8 倍，表明 BP 在金表面存在細菌的情況下可以促進 EC 的粘附和鋪展。 |
本文作者最后指出，雖然 BP 未必能完全阻止細菌的定植或完全消除細菌對正常細胞的負面影響，但通過引入殺菌基團（如 Ag? 或季銨基團）等方法有望大大提高其抗菌性能。
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