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  蛋白和多肽在生命體中具有重要生物學功能，但其實際應用受到易被蛋白酶水解、體內生物利用度低等缺點限制。多肽模擬研究可以針對性地解決多肽體內穩定性差的突出缺點對應用的局限，因此在藥物發現、組織工程、蛋白模擬、生物材料和化學等諸多領域具有重要應用前景。多肽模擬物的降解可調使得多肽可以適配不同應用場景，而多肽序列對其功能的發揮具有重要作用，因此，對酶降解可調和聚合物序列可控是多肽合成和應用研究領域中的關鍵性需求和挑戰。

  在多肽模擬研究領域中，劉潤輝教授課題組前期通過建立對水分不敏感的β-NTA（β-氨基酸N-硫代羧基酸酐）聚合新方法解決了β-內酰胺聚合制備β-多肽的經典合成方法對水分敏感、聚合條件苛刻、功能基團適用性受限的核心挑戰（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 6412-6419）。本研究著眼于解決多肽模擬物對酶降解可調和聚合物序列可控的關鍵性需求和挑戰，通過α-NCA和β-NTA共聚實現了α/β-多肽的可控合成和對蛋白酶降解的調節；通過共聚反應中溶劑對單體聚合速率的調節作用，實現了α/β-多肽的序列可控（圖1）。該研究成果以“Synthesis of Poly-α/β-peptides with Tunable Sequence Via the Copolymerization on N-carboxyanhydride and N-thiocarboxyanhydride”為題發表在iScience上（iScience. 2021, DOI:10.1016/j.isci.2021.103124）。

圖1：序列可調節的α/β-多肽合成

  首先以Boc-α-L-lys NCA和Bn-β³-LCHG NTA為代表性單體，研究不同溶劑對共聚反應的影響，并展示在四氫呋喃溶劑中可控合成一系列不同鏈長（DP = 30-90）、低分散性（?=1.16-1.31）和不同氨基酸比例的α/β-肽。通過用側鏈不同功能化基團的β-NTA單體和α-NCA共聚，展示該方法具有廣泛的底物適用性。

  作者提出并驗證了伯胺引發α-NCA與β-NTA的共聚反應機理為常規胺機理。該機理路線是通過引發劑伯胺親核加成到α-NCA或者β-NTA羰基，開環后脫去CO₂或COS小分子，生成末端為伯胺的活性中間體，重復上述步驟實現共聚反應鏈增長。作者通過高分辨ESI表征引發劑：α-NCA：β-NTA為1：1：1混合物的質譜，發現產物質譜峰主要為末端伯胺的結構；用MALDI-TOF-MS表征引發劑：α-NCA：β-NTA為1：15：15聚合反應產物，發現聚合得到的α/β-多肽C-端均含有引發劑基團，從而支持了常規胺聚合機理。基于常規按機理，α-NCA與β-NTA的共聚反應具有活性聚合特征，因此可成功實現多嵌段α/β-多肽合成以及α/β-多肽的雙端功能化。

  進一步研究發現，α-NCA與β-NTA的共聚反應動力學表現出顯著的溶劑驅動特性。在THF溶劑中，Boc-α-L-lys NCA具有比Bn-β³-LCHG NTA略高的競聚率，兩者的共聚反應接近理想共聚，產物為無規共聚物形式的α/β-多肽。作者進一步合成了模擬宿主防御肽的無規型聚α/β-多肽分子庫，通過摻入不同比例β-氨基酸可以調節α-多肽的抗菌活性。重要的是，β-氨基酸的無規摻入實現了對蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K23）降解的調節（圖2）。

圖2：在TFH中伯氨引發α-NCA與β-NTA的共聚反應

  在CHCl₃/H₂O（95/5，v/v）的混合溶劑中，Boc-α-L-lys NCA和Bn-β³-LCHG NTA的競聚率差異增大24倍，這使得聚合產物為近似嵌段的α/β-多肽，GPC表征結果與理論分子量一致說明在含水混合溶劑中該共聚反應仍然保持可控性。另外，在混合溶劑中兩種單體均聚動力學表明α-NCA可在5min完成聚合，此時聚合體系中β-NTA還剩余98%的未反應（圖3）。

圖3：在CHCl₃/H₂O混合溶劑中伯氨引發α-NCA與β-NTA的共聚反應

  基于溶劑對α-NCA與β-NTA共聚速率的調節作用，作者通過兩種方法實現了序列可調節的α/β-多肽合成。首先，以PEG-NH₂作為引發劑，將Boc-α-L-Lys NCA/Bn-β³-LCHG NTA混合物反復添加到聚合反應中，可以得到具有交替Boc-α-L-Lys嵌段和Bn-β³-LCHG嵌段的十嵌段α/β-多肽。反應液GPC表征結果證實這一方法得到多肽分子量與理論數值一致。然后，作者在PEG-NH₂引發β³-LCHG NTA聚合過程中將Boc-α-L-Lys NCA或α-BLG NCA交替添加到反應液中, 基于α-NCA在該體系中具有遠快于β-NTA單體的聚合速率，從而在β-多肽的相應位置插入一段α-多肽（圖4）。

圖4：在CHCl₃/H₂O混合溶劑中序列可調的α-NCA與β-NTA共聚反應

  多肽的序列控制對納米結構具有重要影響。基于上述序列可調的α-NCA與β-NTA共聚反應通過一鍋法來制備三嵌段聚α/β-多肽具有極好的可重復性，以端基為PEG的三嵌段聚α/β-多肽PEG-poly(Boc-α-L-Lys)-b-poly(Bn-β³-LCHG)為例，六個不同批次的聚合反應得到的產物GPC曲線幾乎完全重合。此外，通過該方法合成α/β-多肽可以通過調節β-氨基酸結構來改變自組裝形貌，從而展現在多肽自組裝研究中的潛力（圖5）。

圖5：在CHCl₃/H₂O混合溶劑中一鍋法合成PEG功能化的三嵌段α/β-多肽自組裝

  本研究論文所建立的序列可控的α-NCA和β-NTA活性共聚方法，實現了合成具有酶降解可調和聚合物序列可控的α/β-多肽突破，為α/β-多肽的合成和功能研究打開了大門，對探索多肽大分子新折疊方式、自組裝結構和生物學功能具有十分重要的意義。

  華東理工大學周敏博士是該論文的第一作者，劉潤輝教授是通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金委等基金的資助。

  論文鏈接: https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(21)01092-0#relatedArticles