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NJIT許曉陽教授、上海交大章雪晴教授 AFM: 脂質體-聚合物雜化納米結構基因遞送平臺用于可冷凍保存的DNA、mRNA新冠疫苗

2022-07-24 來源：高分子科技

關鍵詞：脂質體聚（β-氨基酯）脂質-聚合物雜化納米結構 PNP 納米粒子基因遞送

新冠疫情導致全球性大流行病，對公共衛生和全球經濟造成災難性影響已感染超過 5 億人，導致全球超過 610 萬人死亡（根據世界衛生組織于 2022 年 4 月的數據）。通過各方不懈的研究與合作，新一代的核酸疫苗以創紀錄的方式被研發出來并及時地部署接種，其中包括由Pfizer-BioNTech和Moderna開發的兩款mRNA脂質體納米粒（mRNA-LNP）新冠疫苗。這兩款mRNA-LNP疫苗能夠引發高水平的中和抗體滴度并且有著高達 95%的疫苗有效性，在預防 COVID-19上顯示出巨大潛力。盡管如此，這兩款mRNA-LNP新冠疫苗受到有限保存期和缺乏穩定性的限制，需要將它們保存在 -60 °C 至 -80 °C，以及 -15 °C 至-25°C的環境中，并且同時需要高成本的超冷鏈的運輸條件。目前，冷凍干燥技術已被應用于延長包括小分子藥物、疫苗和基于蛋白質的藥物在內的多種藥劑的保質期。在冷凍保護劑的作用下，冷凍干燥能夠溶劑對疫苗的水解作用并且能夠使其以干粉形式下長期儲存。由于目前的 mRNA-LNP 新冠疫苗全部都是儲存在水相溶液中的，因此，這增加了 mRNA 和 LNP 水解的作用從而導致疫苗的不穩定而失效。

近期，美國新澤西理工學院許曉陽教授團隊聯合上海交通大學藥學院章雪晴教授團隊開發出一類新型脂質體修飾的聚（β-氨基酯）命名為L-PBAE，并進一步與PLGA-PEG自組裝成“Particle-in-Particle”（PNP）新型PNP納米結構用于DNA和mRNA的體外與體內的遞送（圖1）。在眾多PNP 的納米材料庫中，研究人員證明了PNP/C12-PBAE作為性能最佳的納米粒子，能夠在體外和體內高效地遞送DNA和mRNA，并且呈現出增強的轉染效果、緩慢持續的DNA和mRNA的釋放和至少 12 個月在-20 °C的條件下凍干保存而不會損失轉染效率的出色穩定性（圖2）。在包裹刺突蛋白編碼的DNA和mRNA后，脂質體修飾的 PNP 新冠疫苗即使在 -20°C 凍干儲存 12 個月后，仍能在小鼠模型中成功引發刺突蛋白的特異性抗體和 Th1 型的T 細胞免疫反應（圖3）。這種新型脂質-聚合物雜化的 PNP 納米粒子系統為遞送DNA 和 mRNA提供了一種新的策略和方法，并且該遞送系統具有長期凍干儲存的能力。這項工作以“Lipid-polymer hybrid “Particle-in-Particle” nanostructure gene delivery platform explored for lyophilizable DNA and mRNA COVID-19 vaccines”為題發表在《Advanced Functional Materials》（IF=19.92）（DOI：10.1002/adfm.202204462）。該論文的第一作者為新澤西理工學院化工與材料系博士研究生李忠宇。

圖 1. PNP/L-PBAE NPs 的表征。(A) PNP/L-PBAE NPs 的一般示意圖，PNP由三部分組成：(i) L-PBAE/基因納米復合物嵌入整個 PLGA-PEG 納米外殼中，(ii) PLGA層提供持續釋放和保護嵌入的L- PBAE/基因納米復合物，(iii) 外 PEG修飾的納米顆粒表面。(B) PNP/L-PBAE NPs 的代表性 TEM 圖像和 (C) 代表性納米粒子圖像的放大部分。(D) 未嵌入 L-PBAE 的空PLGA-PEG NPs 的代表性 TEM 圖像和 (E) L-PBAE/基因納米復合物的代表性 TEM 圖像。(F) PNP/L-PBAE NPs 的大小和 zeta 電位由動態光散射確定。數據表示為平均值±SD（標準偏差）。

圖 2. PNP/C12-PBAE NPs 在體外和體內轉染效率的綜合評定。(A) 在不同時間點由負載 GFP 質粒 (pGFP) 的PNP/C12-PBAE NPs 轉染的 Hek 293 細胞的熒光圖像以及 FACS 結果。(B) 轉染后 GFP 陽性細胞群的總結和 (C) 根據 FACS 結果顯示的 GFP 陽性細胞的平均熒光強度 (MFI)。(D) 在不同時間點由負載 mCherry mRNA (mCherry) 的PNP/C12-PBAE NPs 轉染的 Hek 293 細胞的熒光圖像以及FACS 結果。(E) 根據 FACS 結果對轉染后 mCherry 陽性細胞群和 (F) mCherry 陽性細胞的 MFI 進行總結。(G) 與 C12-PBAE NPs 相比，PNP/C12-PBAE NPs具有對 pGFP 和 (H) mRNA 的緩慢持續釋放的特性。(I) pGFP和 mRNA負載的PNP 納米顆粒的瓊脂糖凝膠電泳分析。(J) 與對照組相比，在特定時間點注射載有熒光素酶 mRNA (mLuc) 的 PNP (n=3) 后 BALB/c 小鼠的體內生物發光圖像。(K) 使用 pGFP 和 (L) mCherry 作為報告基因對 PNP/C12-PBAE NPs 進行長期儲存后的評估，通過 FACS 結果進行總結并標準化為新鮮的 PNP 基因表達。(M) 在注射后 1 天后記錄 BALB/c 小鼠模型中 PNP 制劑和 ALC-0315 LNP（輝瑞制劑）之間的熒光素酶表達。所有實驗一式三份重復，數據表示為平均值±SD。

圖 3. PNP 新冠疫苗的體外表征和接種小鼠的體液免疫反應。(A) 在 Hek 293 細胞上轉染 DNA-PNP 和 mRNA-PNP 疫苗后刺突蛋白表達的體外蛋白質印跡（WB）。用多克隆抗 SARS-CoV-2 刺突糖蛋白和抗 GAPDH 作為上樣對照對細胞裂解物進行探測。(B) 用 DNA-PNP（上排）和 mRNA-PNP（下排）轉染的 Hek 293 細胞的體外免疫熒光染色。用多克隆抗 SARS 冠狀病毒 2 刺突糖蛋白和 FITC 標記的二抗測量刺突蛋白的表達。細胞核用 DAPI 復染，熒光圖像在明場、DAPI、FITC 和合并通道下拍攝（比例尺，50 μm）。(C) 小鼠免疫和樣品收集計劃示意圖。在第0天和第14天分別給予初免和加強疫苗注射，在第0天、第13天、第21天和第35天收集小鼠血清。在第42天取出接種小鼠的脾臟。(D) 通過 ELISA (n = 5) 確定的 mRNA-PNP 疫苗的刺突蛋白特異性 IgG 抗體滴度。(E) mRNA-PNP 疫苗的 SARS-CoV-2 刺突假病毒中和抗體 IC50 滴度 (n=5) 。 (F) 使用 mRNA-PNP 接種小鼠血清 (n=5) 進行針對野生型原始株SARS-CoV-2 毒株病毒的斑塊減少中和試驗 (PRNT)。(G) 通過 ELISA (n = 5) 確定的 DNA-PNP 疫苗的刺突蛋白特異性 IgG 抗體滴度。(H) DNA-PNP 疫苗的 SARS-CoV-2 刺突假病毒中和抗體 IC50 滴度 (n=5) 。 (I) 使用 DNA-PNP 接種小鼠血清 (n=5) 對野生型原始株SARS-CoV-2 株病毒進行噬菌斑減少中和試驗 (PRNT)。所有數據均表示為平均值±SD。使用具有多重比較檢驗的單向方差分析計算顯著性（ns，不顯著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）。

該工作是團隊關于可凍干并且可長期保存的DNA和mRNA新冠疫苗相關研究的最新進展之一。以脂質體雜化的陽離子聚合物L-PBAE和PLGA-PEG為基礎，開發出新型PNP聚合物納米結構用于基因遞送以及新冠疫苗的研發，并且為可長時間凍干保存的納米顆粒基因遞送系統提供了一種新的解決方案。

原文鏈接 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202204462

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（責任編輯：xu）

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