聚乙二醇（PEG）作為一種經(jīng)典的生物醫(yī)用高分子輔料，廣泛應(yīng)用于大分子藥物（如核酸和蛋白）或納米藥物的表面修飾（即PEG化），顯著提高藥物的水溶性并延長其血循環(huán)時間。然而，近年來在未使用過含PEG化藥物或藥物載體的健康人及臨床患者體內(nèi)檢測到抗PEG抗體，即預(yù)存抗PEG抗體，且伴隨含PEG日化用品的使用增多、檢測抗PEG抗體技術(shù)手段進(jìn)步等，預(yù)存抗PEG抗體的陽性檢出率及水平逐年增加。預(yù)存抗PEG抗體會與納米藥物表面修飾的PEG結(jié)合，激活補體系統(tǒng)，引發(fā)一系列下游的生物學(xué)效應(yīng)，包括加速藥物的血液清除、增加非靶組織蓄積、形成膜攻擊復(fù)合物導(dǎo)致包載藥物提前泄漏、產(chǎn)生超敏反應(yīng)等，嚴(yán)重影響納米藥物的療效與安全性。如何系統(tǒng)設(shè)計并開發(fā)可有效規(guī)避臨床預(yù)存抗PEG抗體的新型PEG輔料，是目前納米藥物遞送領(lǐng)域亟待解決的重要科學(xué)問題。
鑒于此，復(fù)旦大學(xué)占昌友教授團隊通過對多中心臨床大樣本血清進(jìn)行預(yù)存抗PEG抗體篩查，并考察其與不同PEG材料的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)羥基PEG（OH-PEG）能有效規(guī)避臨床預(yù)存抗PEG抗體的結(jié)合。將市售脂質(zhì)納米粒（LNP）配方中的甲氧基PEG（MeO-PEG）替換為OH-PEG，可顯著降低LNP在抗體陽性血清中的補體激活水平，減少過敏毒素的產(chǎn)生，并改善了LNP的血漿穩(wěn)定性，降低巨噬細(xì)胞的脫靶攝取，有望實現(xiàn)LNP的高效遞送，提升藥物體內(nèi)性能。相關(guān)成果發(fā)表于bioRxiv平臺。
抗PEG抗體檢測方法優(yōu)化：0.05%Tween-20/PBS作為洗滌劑不影響抗體結(jié)合
研究人員首先對抗PEG抗體的ELISA檢測方法進(jìn)行了驗證與優(yōu)化，針對當(dāng)前爭議較大的一個問題——含有乙二醇重復(fù)單元的Tween-20是否可以作為洗滌劑用于抗PEG抗體的檢測，進(jìn)行了Tween-20和另一種被用于抗PEG抗體檢測的洗滌劑CHAPS的對比研究。研究人員在血樣孵育后加入不同濃度的Tween-20進(jìn)行競爭結(jié)合，發(fā)現(xiàn)均不影響人血中預(yù)存抗PEG抗體與板中固定的PEG材料的結(jié)合，且在0.05%濃度以下不會影響動物體內(nèi)抗PEG抗體和市售嵌合抗PEG抗體的結(jié)合。相反，使用CHAPS作為洗滌劑無法徹底去除板內(nèi)非特異性結(jié)合的人IgG和HRP標(biāo)記的二抗，從而嚴(yán)重干擾抗PEG抗體的正常檢測。最終，研究人員選擇0.05% Tween-20/PBS作為洗滌劑進(jìn)行后續(xù)實驗。
圖1 Tween-20對抗PEG抗體檢測的影響
人群預(yù)存抗PEG抗體檢出率：18%人血樣本呈現(xiàn)結(jié)合強陽性
研究人員選取目前市售PEG化制劑配方中的MeO-PEG作為抗原，利用ELISA檢測了2074例健康人血清中的抗PEG IgM和IgG水平，并選取125例樣本進(jìn)行抗體滴度與1:4血清濃度時的吸光度值擬合，發(fā)現(xiàn)二者之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。這表明可以使用1:4血清濃度的吸光度值來代替滴度值，以進(jìn)行大量樣本的篩選，從而反映抗體水平的高低。將吸光度值大于1定義為強陽性（++），吸光度值在0.5-1之間定義為陽性（+），吸光度值小于0.5定義為陰性（-），發(fā)現(xiàn)人群中預(yù)存抗PEG IgM的陽性率要遠(yuǎn)高于抗PEG IgG。其中女性的抗體水平要高于男性，且呈現(xiàn)出隨著年齡增加抗體水平逐漸降低的趨勢。進(jìn)一步對55例健康人不同時間點（大于3個月時間間隔）血清樣本進(jìn)行抗體檢測，發(fā)現(xiàn)其抗體水平幾乎沒有變化，說明人體預(yù)存抗PEG抗體是持久存在的，可能對PEG化納米藥物產(chǎn)生長期影響。
圖2 人群預(yù)存抗PEG抗體檢出率
人群抗PEG抗體結(jié)合選擇性：羥基PEG可規(guī)避抗體結(jié)合
研究人員選取了40例預(yù)存抗PEG抗體陽性樣本，利用ELISA檢測其與四種不同端基PEG材料（甲氧基、氨基、羧基和羥基）的結(jié)合活性。結(jié)果顯示，預(yù)存抗體與PEG的結(jié)合呈現(xiàn)出明顯的端基選擇性，其中MeO-PEG結(jié)合最強，OH-PEG最弱。進(jìn)一步選取人群樣本中的所有抗體強陽性樣本及部分陰性樣本，對比甲氧基與羥基的結(jié)合活性，結(jié)果顯示預(yù)存抗PEG IgM及IgG均主要識別MeO-PEG，而OH-PEG可有效規(guī)避預(yù)存抗體。研究人員還利用等溫滴定量熱法（ITC）檢測抗PEG抗體與不同PEG材料結(jié)合時的放熱情況，發(fā)現(xiàn)人血樣本與OH-PEG滴定后釋放的熱量遠(yuǎn)低于MeO-PEG，進(jìn)一步驗證了OH-PEG規(guī)避臨床預(yù)存抗PEG抗體的結(jié)合。
圖3 人群預(yù)存抗PEG抗體的端基選擇性
OH-PEG構(gòu)建的LNP能有效改善預(yù)存抗PEG抗體結(jié)合引起的不良效應(yīng)
基于上述發(fā)現(xiàn)，研究人員將市售脂質(zhì)納米粒（Spikevax（Moderna））配方中的MeO-PEG替換為OH-PEG，考察其對預(yù)存抗PEG抗體結(jié)合及對下游生物學(xué)效應(yīng)（如補體激活、血清穩(wěn)定性、靶細(xì)胞與非靶細(xì)胞攝取）的影響。結(jié)果顯示，OH-LNP吸附預(yù)存抗PEG抗體顯著減少，導(dǎo)致補體激活水平減弱，有望緩解因補體激活引起的臨床輸液反應(yīng)和超敏反應(yīng)等副作用。由于補體激活產(chǎn)物——膜攻擊復(fù)合物C5b-9的減少，OH-LNP在血清中的穩(wěn)定性提高，同時在不影響靶細(xì)胞（肝細(xì)胞）攝取的前提下顯著減少了巨噬細(xì)胞的攝取，有望避免LNP在體內(nèi)被快速清除，提升藥物體內(nèi)性能。
圖4 人群預(yù)存抗PEG抗體結(jié)合與下游生物學(xué)效應(yīng)的差異
抗PEG抗體的結(jié)合位點存在物種差異
由于目前缺乏對人群中預(yù)存抗PEG抗體起源與產(chǎn)生機制的充分認(rèn)知，大多數(shù)臨床前試驗均采用PEG化納米載體（多為脂質(zhì)體）來刺激產(chǎn)生抗PEG抗體。研究人員對小鼠、大鼠和比格犬體內(nèi)經(jīng)過刺激產(chǎn)生的抗PEG抗體進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)與人預(yù)存抗PEG抗體不同，動物體內(nèi)經(jīng)PEG化脂質(zhì)納米載體刺激所產(chǎn)生的抗體主要結(jié)合乙二醇重復(fù)單元，對PEG末端基團無選擇性。進(jìn)一步考察補體激活的物種差異，發(fā)現(xiàn)OH-LNP在小鼠和大鼠血清中增加了補體激活水平的跡象，在比格犬血清中與MeO-LNP的補體激活水平相當(dāng)，而在人血清中補體激活水平顯著減少。這一現(xiàn)象與補體系統(tǒng)的物種差異有關(guān)。抗PEG抗體結(jié)合模式和補體激活途徑的物種差異可能會誤導(dǎo)研究者將注意力轉(zhuǎn)向被認(rèn)為是惰性的MeO-PEG，從而阻礙OH-PEG的基礎(chǔ)研究、臨床開發(fā)與應(yīng)用。
圖5抗PEG抗體的物種差異
羥基LNP免疫原性較低
考慮到LNP在使用時往往需要重復(fù)給藥，因此在動物體內(nèi)考察了重復(fù)注射LNP后抗PEG抗體的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，在比格犬中，重復(fù)注射MeO-LNP誘導(dǎo)了明顯的抗PEG IgM和IgG抗體，而OH-LNP產(chǎn)生的抗體水平較低，即免疫原性更低。在小鼠中，兩種LNP均未產(chǎn)生明顯的抗PEG抗體，這可能是由于PEG-DMG快速從LNP上脫落，以及小鼠對PEG材料相較于比格犬更不敏感所致。綜上所述，OH-LNP的免疫原性顯著低于MeO-LNP，有利于滿足臨床重復(fù)給藥的需求。
圖6重復(fù)注射LNP后在比格犬體內(nèi)產(chǎn)生的抗PEG抗體水平
本研究首次發(fā)現(xiàn)人群預(yù)存抗PEG抗體對PEG的結(jié)合具有端基選擇性，羥基PEG有能力規(guī)避預(yù)存抗PEG抗體的識別，從而顯著降低脂質(zhì)納米粒的補體激活水平，改善下游生物學(xué)效應(yīng)，對降低臨床脂質(zhì)納米粒的副作用、提升臨床應(yīng)用效果具有重要意義。
原文信息：
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.10.21.619346v1
