近年來,“自下而上”模塊化組織工程的發展及體外構建具有特定結構和功能的微組織得到了迅速發展。但是,目前很多“自下而上”組裝方法還只是一些初步的探索性研究,如果構建的三維組織中沒有可以利用血管網絡來輸送營養和移除代謝產物,組織厚度則難以有效增大。因此,如何利用微載體在體外構建模塊化內皮細胞-微纖維復合生物支架并利用其可注射性避免手術創傷進行原位再生新生血管具有重要的研究意義。
華僑大學陳愛政教授課題組和哈佛醫學院Y. Shrike Zhang教授課題組以海藻酸鈉(sodium alginate, SA)和明膠(gelatin, Gel)為原料,通過微流控液滴融合技術及離子交聯技術相結合的方法,在內包裹人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的海藻酸/明膠微液滴和氯化鈣微液滴融合的同時,在受限空間內使液滴迅速固化成微纖維狀,并利用明膠在后期不同程度的固定控制細胞的遷移和生長,在短纖維內部形成具有中空結構的細胞層,從而模擬模塊化血管的結構和功能,并在體外和動物體內實驗進行了初步的驗證。
圖1 研究示意圖
通過微流控液滴融合技術及離子交聯技術相結合的方法得到分散性好、長徑比均一的海藻酸鹽棒狀微纖維,并通過Minitab全因子實驗設計方案,考察結果表明海藻酸鹽濃度、連續相分散性流速比對微纖維的長徑比影響顯著。另外,將明膠加入到海藻酸鈉中,可提高海藻酸鹽的細胞相容性,且不影響海藻酸/明膠復合微液滴與氯化鈣液滴的有效融合。
圖2 (A)微纖維的制備流程示意圖(B-F)Minitab全因子實驗分析(G)微纖維明場圖。
為進一步探究明膠對內包裹的HUVECs增殖和遷移的作用,利用京尼平(genipin)對得到的微纖維進行明膠不同程度的固定,固定時間設置為10 min、30 min,同時設置不固定明膠組作為對照組。結果發現,在固定時間為10 min時,微纖維外部產生了更有利于細胞增殖的微環境,而微纖維內部的明膠由于沒有得到有效固定,導致內部的細胞逐漸開始向外遷移。最終在HUVECs在微纖維內部共培養21天后,形成了中空結構的細胞層。HE體外支架染色對結果進行了進一步的驗證。
圖3. (A)支架中HUVECs共培養21天后CD31及VE-Cad蛋白表達情況(B)3D掃描支架觀察細胞分布(C)對微纖維進行免疫組化染色(D)支架中細胞基因表達情況分析。
為進一步實驗該微纖維與體內組織的相互作用,將內包裹HUVECs的微纖維體外培養21天后,通過皮下注射到SCID小鼠耳后組織,研究其在小鼠體內的相互作用,設置未負載HUVECs的空白微纖維支架為對照組。可以觀察到,相比于空白支架組,實驗組引起了更多的巨噬細胞的聚集,并在注射后21天時,支架周圍產生小血管。
圖4.(A)將微纖維注射入體內后HE染色及(B)CD31免疫組化染色。
以上相關成果以“Endothelialized Microrods for Minimally Invasive in situ Neovascularization”為題近期在線發表于Biofabrication。論文第一作者為華僑大學生物材料與組織工程研究所17級博士生王穎。通訊作者為哈佛醫學院Y. Shrike Zhang教授和華僑大學陳愛政教授。華僑大學2016級碩士研究生胡璇、Ranjith Kumar Kankala博士、王士斌教授和福建醫科大學楊達云博士、復旦大學中山醫院朱鎧博士為論文的共同作者。
華僑大學部分的研究工作得到國家自然科學基金海峽聯合重點項目《可注射型復合生物支架介導血管化肌組織原位再生的研究》(U1605225)及福建省生物材料科技創新團隊項目的資助。
論文鏈接:https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ab47eb
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