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東華大學郭睿教授/史向陽教授課題組《ACS AMI》：雙響應核殼樹狀分子用于腫瘤細胞的基因編輯增強免疫檢查點阻斷治療

2023-03-24 來源：高分子科技

關鍵詞：免疫檢查點阻斷療法 PD-L1 CRISPR/Cas9 雙響應核殼結構樹狀大分子 CT成像

免疫檢查點阻斷（ICB）療法通過激活免疫系統來抑制腫瘤的發生和轉移，已成為一種極具前景的治療策略。在眾多的檢查點中，程序性死亡配體1（PD-L1）被認為是腫瘤相關免疫抑制和腫瘤進展的關鍵調節因子，已被用作臨床治療實體腫瘤的治療靶點。目前，常用單克隆抗體或小干擾RNA（siRNA）來阻斷PD-L1/PD-1通路，但存在耐久性差、免疫反應低等問題。因此，永久性、特異性地抑制腫瘤細胞中PD-L1基因的表達，有望實現更有效、更持久ICB治療。

作為一種前沿的基因組編輯工具，聚類規則穿插短回文重復序列（CRISPR）-相關蛋白9（CRISPR/Cas9）系統為癌癥的治療提供了新的思路。CRISPR/Cas9具有精確高效的基因編輯能力，能夠在sgRNA的引導下識別特定的DNA序列，并通過Cas9核酸內切酶切割目標PD-L1基因，調控腫瘤細胞PD-L1的表達。在腫瘤治療中，基于質粒的CRISPR/Cas9系統因其結構簡單、成本低、整合效率高而被廣泛應用。提高靶標特異性和基因編輯效率是CRISPR/Cas9系統在免疫治療中的關鍵，因此迫切需要開發靶向腫瘤和響應性的納米載體，以精確和有效地在腫瘤細胞內傳遞CRISPR/Cas9質粒。

東華大學郭睿教授/史向陽教授課題組構建了一種雙響應的負載Au納米顆粒核殼結構樹狀大分子納米平臺（Au CSTDs），用于有效壓縮和響應性釋放“切除PD-L1基因的CRISPR/Cas9質粒”（Cas9-PD-L1），實現腫瘤靶向的高效、持久的ICB治療（圖1）。研究團隊首先以包裹金納米顆粒、乳酸（LA）修飾的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子為核心，以連接苯硼酸（PBA）的第三代樹狀大分子為外殼，通過LA和PBA形成苯硼酸酯鍵構建了pH/ROS響應的負載金納米顆粒的核殼樹狀大分子Au CSTDs。通過其表面PBA與腫瘤細胞中過表達的唾液酸結合完成特異性的腫瘤傳遞，并在腫瘤弱酸性和高ROS下解離，實現Cas9-PD-L1的響應性釋放和有效轉染、敲除腫瘤細胞的PD-L1基因，實現持久高效的ICB免疫治療。其中，金納米顆粒在提高基因轉染效率的同時，可以實現CT成像可視化追蹤。

圖1. (Au⁰)₂₅-G5-LA/PBA-G3（Au CSTDs）的合成方案及基于ICB癌癥免疫治療的CRISPR/Cas9傳遞機制

研究團隊通過¹H NMR、UV-vis和2D NOESY證明了金納米顆粒的成功包裹以及核殼樹狀大分子的成功構建（圖2A-C）。TEM、AFM以及水合粒徑分布圖顯示出Au CSTDs呈球形，且大小均一（圖2D-F）。Au CSTDs的紅細胞溶血率低于5%，具有良好的血液相容性。此外，通過熒光光譜分析驗證了苯硼酸酯鍵在低pH和高H₂O₂的響應性斷裂，這將導致Au CSTDs在腫瘤微環境下發生pH和H₂O₂響應性分解（圖2H和I）。

圖2. (A) (Au⁰)₂₅-G5-LA、G3-PBA和Au CSTDs的¹H NMR譜。(B) G5-LA、(Au⁰)₂₅-G5-LA和Au CSTDs的紫外-可見光譜。(C) Au CSTDs的2D NOESY光譜。(D) Au CSTDs的TEM圖像和大小分布直方圖。(E)AFM圖像和Au CSTDs的高度輪廓。(F)各物質在水中的水合粒徑圖。(G)不同濃度的Au CSTDs對小鼠的溶血率。陽性對照為1%的Triton X-100 (TX-100)，陰性對照為PBS。插圖顯示了與材料共孵育2小時離心后的照片。(H) Au CSTDs在pH為7.4、6.4和5.4時的熒光激發光譜。(I) Au CSTDs在含H₂O₂ (0.1 mM) pH = 7.4的熒光激發光譜。所有激發光譜均使用388 nm的發射波長。PBA的濃度固定在1 mM。

研究團隊構建了CRISPR/Cas9質粒系統，其中包含了sg RNA、Cas9蛋白以及增強型綠色熒光蛋白的DNA序列，用于后續的實驗（圖3A）。瓊脂糖凝膠阻滯實驗表明，當N/P為1時材料可將質粒完全壓縮（圖2B），將載體/質粒復合物置于低pH和H₂O₂存在條件下，Au CSTDs可以響應斷裂且釋放出質粒（圖2C）。圖2D驗證高N/P條件下，納米復合物在腫瘤微環境條件下水合粒徑明顯增大，結構變得松散，利于質粒的釋放。因此，Au CSTDs可以作為載體來壓縮和響應性釋放CRISPR/Cas9質粒系統。隨后，研究團隊進行了細胞實驗，CCK-8實驗證明材料具有良好的細胞相容性（圖2E），綠色熒光蛋白轉染實驗表明，核殼結構可以有效轉染質粒，并且最佳N/P為15（圖2F和G）。

圖3. (A) Cas9-PD-L1質粒和靶向PD-L1的sgRNA序列。(B)不同N/P比下， Au CSTDs壓縮Cas9-PD-L1質粒的瓊脂糖凝膠阻滯試驗。1：DNA Marker (5000 bp)；2：游離Cas9-PD-L1；3?8：N/P比分別為0.125、0.25、0.5、1、2和5。(C) N/P = 10時，在不同環境下Au CSTDs壓縮Cas9-PD-L1質粒的瓊脂糖凝膠阻滯試驗。(D)不同N/P比下Vector/Cas9-PD-L1的水合粒徑。(E)不同載體濃度的Vector、Vector/Cas9-PD-L1和Vector/ Cas9-NC處理的B16-F10細胞24小時的活力測定。Cas9-NC質粒中的sgRNA被無序DNA取代。(F)在N/P分別為2、5、10、15、20和30時，PBS、Cas9-PD-L1和Vector/Cas9-PD-L1轉染B16-F10細胞后的代表性流式細胞儀圖和(G)相對平均熒光強度。

接下來，研究團隊探索了Au CSTDs靶向傳遞的細胞內機制。細胞吞噬實驗表明，PBA可以靶向腫瘤表面的唾液酸，并且細胞對復合物的攝取量隨時間延長而增多（圖4A）。溶酶體逃逸實驗表明，加入復合物兩小時后材料進入細胞，四小時后基因可進入溶酶體，八小時后基因從溶酶體出來，并有進入細胞核的趨勢（圖4B和C）。針對含金、響應、靶向三種特性，團隊構建對照材料后進行了綠色熒光轉染實驗，結果顯示雙響應的Au CSTDs/Cas9-PD-L1系統由于腫瘤細胞的特異性攝取、響應性基因釋放和強烈的內體逃逸，展現出更高的基因轉染效率。

圖4. (A) B16-F10細胞對Vector/Cas9-PD-L1在不同時間的細胞攝取。PBA作為阻斷劑：加入Vector/Cas9-PD-L1前10分鐘，用游離的PBA（4 mM）處理B16-F10細胞。(B)用Cy3標記的Cas9-PD-L1與Au CSTDs復合后處理2、4和8小時時，B16-F10細胞的共聚焦顯微圖像和相應的共定位熒光強度剖面分析以及(C) Cy3（紅色熒光）和溶酶體（綠色熒光）之間的共定位率。細胞核用Hoechst 33342染色。溶酶體用LysoTracker綠色染色。比例尺:20 μm。PBS、nCSTD（非靶向非響應）、PBA + Au CSTDs（非靶向有響應）、Au CSTDs（有靶向有響應）和CSTD（不含納米金顆粒）分別壓縮Cas9-PD-L1質粒后，與B16-F10細胞孵育4 h后的(D)相對平均熒光強度與(E)熒光圖像。PBA作為阻斷劑。比例尺：100 μm。

研究團隊進一步驗證了Au CSTDs遞送CRISPR-Cas9系統的作用機制。T7核酸內切酶I證實了該系統有效的基因編輯能力，它可以在DNA水平上顯著降低PD-L1基因。值得注意的是，用Au CSTDs作為載體遞送系統，比游離Cas9-PD-L1的對照組基因編輯效率增加了7.1倍（圖5A）。RT-PCR以及WB實驗證明，CRISPR-Cas9系統可以進一步降低PD-L1基因的RNA水平以及蛋白質水平（圖5B和C）。

圖5. (A) PD-L1基因組位點的T7EI檢測，(B) PD-L1基因表達的RT-PCR檢測，(C) PBS、Cas9-PD-L1、Vector/Cas9-PD-L1和Vector /Cas9-NC轉染后PD-L1蛋白表達的WB檢測。在(B)和(C)中，PBS處理的細胞表達量設為1.0。

考慮到Au納米顆粒具有良好的X射線衰減特性，研究團隊對Au CSTDs的CT成像性能進行評價。與臨床造影劑碘海醇相比，Au CSTDs具有更好的X-線衰減能力（圖6A）。隨后，研究團隊建立了B16-F10腫瘤模型研究Au CSTDs在體內的積累和分布。結果顯示，注射材料1小時后，Au在腫瘤及各器官中的含量達到峰值，隨后逐漸被代謝出體外（圖6B-D）。

圖6. (A)不同濃度的Au CSTDs和碘海醇中Au或I的的CT圖像和HU值。(B) B16-F10腫瘤模型瘤周注射Au CSTDs（[Au] = 5 mM）后，不同時間間隔的CT圖像和HU值。腫瘤區域用紅色圈出。(D)瘤周注射Au CSTDs后，小鼠主要器官和腫瘤在不同時間的Au含量的生物分布。

團隊研究評價了Au CSTDs/Cas9-PD-L1對B16-F10荷瘤小鼠的ICB治療效果。經過治療，相對于PBS組和載體/Cas9-NC組，Anti-PD-L1組和載體/Cas9-PD-L1組的腫瘤生長受到了一定的抑制，且載體/Cas9-PD-L1的抗腫瘤效果最好，且組間的小鼠體重變化較小（圖7A-D）。HE、TUNEL和ki-67染色結果顯示，治療組可以促進腫瘤組織的壞死和凋亡，并且抑制腫瘤細胞的生長（圖7E和F）。

圖7. (A)體內腫瘤免疫治療的示意圖及時間軸。小鼠的(B)相對腫瘤體積變化、(C)分離腫瘤的照片和重量以及(D)不同治療組的體重變化。每組6只小鼠。(E)第12天B16-F10腫瘤組織的H&E、TUNEL和Ki-67染色圖片。比例尺：50 μm。(F)腫瘤切片中TUNEL陽性細胞和Ki-67陽性細胞的百分比。

最后，團隊探究了載體/Cas9-PD-L1抑制腫瘤的機制。WB實驗和免疫熒光圖片顯示出，載體/Cas9-PD-L1組以及Anti-PD-L1組腫瘤部位PD-L1蛋白的表達顯著下降，以及浸潤的CD4⁺和CD8⁺ T細胞的增加（圖8A和B）。并且，兩組均可引起脾臟部位CD4⁺和CD8⁺ T細胞的表達增加、Tregs細胞的表達下降（圖8C-F）以及血清中細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌上升（圖8G-I所示）。

圖8. (A)腫瘤組織中PD-L1蛋白表達的圖像和定量分析。PBS處理的腫瘤組織中PD-L1的表達設置為1.0。(B)腫瘤組織中PD-L1蛋白、CD4和CD8 T細胞的免疫熒光染色。比例尺：50 μm。脾臟中T細胞的流式細胞術分析。(C) CD4⁺/CD8⁺ T細胞和CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ T細胞（Tregs）的點圖。(D) CD4⁺和(E) CD8⁺ T細胞的比例和(F) Tregs的比例。(G)第12天血清中TNF- α、(H) IFN-γ和(I) IL-6的定量分析。

簡言之，研究團隊設計的pH和H₂O₂敏感的Au CSTD納米材料可以壓縮和響應性釋放CRISPR/Cas9質粒，通過永久性和特異性地破壞腫瘤細胞中PD-L1的表達，實現ICB治療。Au CSTDs/Cas9-PD-L1通過靶向過表達唾液酸被腫瘤細胞特異性攝取，隨著苯硼酸酯鍵的斷裂Cas9-PD-L1被響應性釋放出來，并定位于細胞核有效地切割PD-L1基因。體內實驗證明，Au CSTDs/Cas9-PD-L1系統可以特異性聚集于腫瘤實現增強的CT成像，顯著降低腫瘤細胞的PD-L1表達、誘導CD4⁺/CD8⁺ T細胞分布增加、減少免疫抑制細胞比例、上調細胞因子TNF-α/IFN-γ/IL-6，表現出顯著的腫瘤抑制效果。因此，本研究制備的Au CSTD納米材料為遞送CRISPR/Cas9質粒用于ICB治療提供了新的思路。

以上研究成果以“Dual-Responsive Core?Shell Tecto Dendrimers Enable Efficient Gene Editing of Cancer Cells to Boost Immune Checkpoint Blockade Therapy”為題，發表于國際著名期刊ACS Applied Materials & Interfaces（2023, 15, 12809-12821）。東華大學生物與醫學工程學院郭睿教授和史向陽教授為通訊作者，碩士研究生劉俊潔為第一作者。該工作得到了國家自然科學基金、上海市人才發展基金、上海市科學技術委員會等項目的資助。

文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.2c22584

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（責任編輯：xu）

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