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東華大學沈明武/史向陽ACS Nano:腦內(nèi)遞送仿生含磷樹狀大分子/抗體納米復合物用于調(diào)節(jié)T細胞和自然殺傷細胞增強膠質(zhì)瘤免疫治療
2024-03-28  來源:高分子科技

  膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具侵襲性和致死性的腫瘤之一,患者的中位生存期短,預后差,因此仍然是臨床醫(yī)學中最具挑戰(zhàn)性的疾病之一。傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、化療和放療,然而由于血腦屏障(BBB)和膠質(zhì)瘤細胞的浸潤,傳統(tǒng)治療往往難以改善患者的功能預后和治療效果。相比之下,免疫療法具有毒性輕、不良反應少、療效高的特點,在各種疾病的治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。


  基于免疫檢查點阻斷(ICB)的免疫治療利用相關(guān)抑制劑(如程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)抗體(aPD1)和程序性細胞死亡配體1(PD-L1)抗體)阻斷負性免疫調(diào)節(jié)途徑,重新激活抗腫瘤免疫應答。特別是,PD-1是一種在T細胞和自然殺傷細胞(NK)上均表達的抑制性受體,可與多種腫瘤細胞上表達的PD-L1結(jié)合,從而導致腫瘤的免疫逃逸。此外,NK細胞作為淋巴細胞中的一種先天免疫細胞,具有直接破壞腫瘤細胞的能力,同時也可以協(xié)助T細胞破壞異常細胞。阻斷T細胞和NK細胞上的PD-1受體,重新激活免疫細胞,對于使用aPD1等抑制劑改善腫瘤免疫治療具有至關(guān)重要的意義。


  對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的免疫治療,由于大多數(shù)治療藥物分子(如抗體和酶)必須穿過血腦屏障才能到達腫瘤部位,這一過程被證明是困難的。因此,開發(fā)一種能夠穿透血腦屏障的多功能藥物傳遞系統(tǒng),有效地將抗體遞送到腦膠質(zhì)瘤部位顯得尤為重要。近年來,研究人員對納米技術(shù)進行了大量的研究,發(fā)現(xiàn)仿生納米技術(shù)在藥物遞送領(lǐng)域有著巨大的潛力。其中,利用細胞膜構(gòu)建的仿生納米藥物以其優(yōu)異的生物相容性、長循環(huán)效應和腦靶向性可以高效地促進納米材料穿透血腦屏障。


  除了抗體介導的ICB治療外,開發(fā)具有內(nèi)在免疫調(diào)節(jié)活性的納米載體系統(tǒng)用于聯(lián)合和增強腫瘤免疫治療也至關(guān)重要。在許多不同的遞送體系中,含磷樹狀大分子以其高度支化的三維結(jié)構(gòu)、可功能化的表面和均勻的分子量而備受關(guān)注。亞磷酸鈉鹽封端的含磷樹狀大分子不僅可以作為納米載體遞送化療藥物,還可以作為免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)NK細胞、巨噬細胞等用于對抗炎癥性疾病或腫瘤。此外,亞磷酸鈉鹽封端的含磷樹狀大分子已被證明是一種通用的蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng),因為它們具有末端亞磷酸鈉鹽陰離子基團和富含苯環(huán)的支鏈支架結(jié)構(gòu),并且可以通過靜電相互作用、氫鍵、陽離子-Π和疏水相互作用負載蛋白質(zhì)。


  為了解決腦膠質(zhì)瘤的免疫逃逸問題以及增強其免疫治療效率,東華大學沈明武研究員/史向陽教授團隊法國國家科學研究中心配位化學實驗室Jean-Pierre Majoral院士團隊合作構(gòu)建了一種基于M1型巨噬細胞膜(M1m)包覆的仿生含磷樹狀大分子/抗體納米藥物平臺,用于增強膠質(zhì)瘤的免疫治療(圖1)。研究團隊首先將含磷樹狀大分子(稱為AK128)與aPD1絡(luò)合形成AK128-aPD1納米藥物,并通過物理擠壓包覆M1m得到最終納米藥物AK128-aPD1@M1m。M1m偽裝的AK128-aPD1@M1m表面具有α4和β1整合素,能夠與內(nèi)皮細胞表面血管內(nèi)皮細胞粘附分子(VCAM-1)結(jié)合,從而穿透血腦屏障,將具有免疫調(diào)節(jié)活性的AK128和aPD1共同遞送到原位膠質(zhì)瘤部位。研究發(fā)現(xiàn),含磷樹狀大分子AK128可以促進外周血單個核細胞(PBMCs)中的NK增殖,而遞送的aPD1可以通過ICB重新激活T細胞和NK細胞促進腫瘤細胞凋亡,同時減少了調(diào)節(jié)性T細胞的腫瘤分布,從而刺激各種細胞因子,增強膠質(zhì)瘤的免疫治療。 


圖1AK128-aPD1@M1m納米藥物的制備及協(xié)同調(diào)節(jié)NK細胞和T細胞增強膠質(zhì)瘤的免疫治療。


  研究發(fā)現(xiàn)按照AK128/抗體質(zhì)量比為4:1時,合成的AK128-aPD1@M1m具有合適的水合粒徑尺寸和表面電勢(圖2A-B)。TEM、SEM圖像顯示制備的AK128-aPD1 NCs粒徑分布均一以及AK128-aPD1@M1m NCs表面M1m涂層的成功包覆(圖2C-F)。采用SDS-PAGE再次驗證抗體負載和M1m包覆成功(圖2G)。通過Western blot實驗驗證了AK128-aPD1@M1m NCs穿透血腦屏障的機制是材料表面仍保留α4和β1整合素,可通過胞吞作用促進腦內(nèi)遞送(圖2H)。同時驗證了所獲得的AK128-aPD1@M1m具有良好的穩(wěn)定性(圖2I)。 


2.(A-B)不同材料的水動力尺寸和表面電勢。AK128-aPD1 NCs的TEM圖像(C)、SEM圖像(D)和(E)尺寸分布直方圖。(F)AK128-aPD1@M1m NCs的TEM圖像。(G)不同材料的SDS-PAGE分析。(H)WB測定α4和β1整合素在AK128-aPD1@M1m中的表達情況。(I)AK128-aPD1@M1m NCs一周內(nèi)的水合粒徑變化。


  研究團隊通過細胞毒性實驗驗證了AK128-aPD1@M1m NCs具有良好的細胞相容性(圖3A-B),通過細胞吞噬實驗證明了M1m的偽裝使巨噬細胞對AK128-Cy5.5-IgG@M1m NCs的攝取減少,這有望延長NCs在體內(nèi)的血液循環(huán)時間(圖3C)。此外,團隊研究了AK128-aPD1@M1m NCs在與PBMCs孵育后激活NK細胞的能力,實驗結(jié)果表明,制備的納米藥物可使PBMCs中NK細胞比例顯著增加(圖3D-E),進一步研究發(fā)現(xiàn)處理后的PBMCs中釋放出更多的細胞因子IFN-γ,表達更高水平的顆粒酶B和穿孔素,能更好地殺傷腫瘤細胞(圖3F-H)。 


3.(A-B)不同材料處理24 h后的C6細胞和bend.3細胞的活力測定。(C) 激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞對不同材料的攝取情況。(D-E)不同材料處理PBMCs后NK細胞比例的代表性流式細胞術(shù)圖和定量分析圖。不同材料處理后(F)顆粒酶B的熒光強度直方圖,(G)IFN-γ和(H)穿孔素的表達分泌測定。(D-H):Ⅰ,PBS;Ⅱ- 2;Ⅲ,Il-2 + AK128;Ⅳ,IL-2 + AK128-aPD1;V,IL-2 + AK128-aPD1@M1m。


  團隊通過體外Transwell模型驗證了IL-2 + AK128-aPD1和AK128-aPD1@M1m處理后的PBMCs可更高效地誘導C6細胞凋亡(圖4A-C),這歸因于AK128介導的NK細胞增殖促進和aPD1介導的NK細胞ICB治療,促進了促凋亡蛋白Bax、p53、PTEN和Caspase-3的上調(diào)和抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)(圖4D)。團隊又通過Transwell系統(tǒng)建立了體外血腦屏障模型,驗證了AK128-aPD1@M1m NCs可以更高效地穿過血腦屏障且保證了b.End3單細胞層的完整性(圖4E-G)。接下來,團隊通過激光共聚焦顯微鏡研究了納米材料釋放的抗體是結(jié)合在T細胞表面發(fā)揮ICB作用從而刺激恢復T細胞活性(圖4H)。 


4.(A)不同材料處理后的PBMCs與C6細胞體外共孵育的示意圖。(B-C)不同處理12 h后C6細胞凋亡和壞死的流式細胞分析及(D)凋亡相關(guān)蛋白的Western blot試驗結(jié)果圖。(B-D):Ⅰ,PBS;Ⅱ,IL-2 + PBS;Ⅲ,IL-2 + aPD1;Ⅳ,IL-2 + AK128;V,IL-2 + AK128-aPD1;Ⅵ,IL-2 + AK128-aPD1@M1m。(E)體外血腦屏障Transwell模型的構(gòu)建示意圖。(F)不同材料處理前后b.End3細胞層的跨膜電阻變化及(G)穿過血腦屏障的效率分析圖。(H)不同材料與T細胞結(jié)合能力的激光共聚焦顯微鏡圖像。 


5.(A)原位膠質(zhì)瘤的體內(nèi)診斷和治療過程。(B-C)小動物活體熒光成像系統(tǒng)測定不同材料處理后荷瘤小鼠腦部的活體熒光成像圖片和平均輻射效率。(D)不同處理后C6膠質(zhì)瘤小鼠的MR圖像、(E)相對腫瘤體積變化和(F)小鼠體重變化。(G)不同材料組小鼠腦膠質(zhì)瘤切片的H&E、TUNEL、Ki67染色。


  隨后,研究團隊評估了AK128-aPD1@M1m在體內(nèi)的抗腫瘤免疫效果(圖5A)。小動物活體熒光成像結(jié)果表明AK128-Cy5.5-IgG@M1m NCs可以通過M1m的偽裝有效地穿透血腦屏障到達大腦部位,熒光強度在6 h達到峰值(圖5B-C)。在治療期間采用實時T1加權(quán)MR成像系統(tǒng)測量不同時間的腫瘤體積,結(jié)果表明AK128-aPD1@M1m組在體內(nèi)抗腫瘤效果明顯優(yōu)于其他組(p < 0.01,圖5D-E),這可能是由于AK128-aPD1@M1m NCs具有血腦屏障穿越能力,能夠?qū)K128和aPD1共同傳遞到腫瘤部位,從而發(fā)揮AK128(NK細胞增殖)和aPD1(T細胞和NK細胞的ICB)的聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)作用,增強膠質(zhì)瘤的免疫治療效果。M1m的偽裝使NCs的血液循環(huán)時間延長,表現(xiàn)出增強的腫瘤蓄積作用。此外,不同處理后小鼠體重均無明顯變化,說明包括AK128-aPD1@M1m在內(nèi)的所有納米材料均具有良好的體內(nèi)生物相容性(圖5F)。為了進一步檢驗治療效果,取不同材料治療后的小鼠腦部進行H&E、TUNEL和Ki67染色,結(jié)果表明AK128-aPD1@M1m治療組的腫瘤細胞壞死、細胞凋亡均最多,增殖抑制效果最好(圖5G)。 


6.(A-D)不同治療后腫瘤中CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、顆粒酶B陽性CD8+ T細胞和Tregs細胞的代表性流式細胞術(shù)圖。(E-H)腫瘤組織中CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、顆粒酶B陽性CD8+ T細胞和Tregs分布的定量分析。 


7.(A-C)不同材料治療11天后外周血、腫瘤和脾臟部位CD3-NK1.1+細胞的代表性流式細胞術(shù)圖。(D)不同治療材料后腫瘤組織中NK細胞分布的定量分析。(E-G)不同材料治療11天后血清細胞因子TNF-α、IFN-γ、顆粒酶B的ELISA測定結(jié)果。


  接下來,團隊探索了AK128-aPD1@M1m NCs抗腫瘤的相關(guān)免疫治療機制,采集治療后11天小鼠的腦部,對相關(guān)免疫細胞進行了流式細胞術(shù)分析,結(jié)果表明AK128-aPD1@M1m組在腫瘤中的CD4+T細胞、CD8+ T和顆粒酶B陽性CD8+ T細胞比例均最高(圖6A-C、6E-G),調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)的分布在所有組中最低(圖6D、6H)。此外,團隊研究了NK細胞在外周血、腫瘤和脾臟中的分布,AK128-aPD1@M1m治療在所有組中NK細胞的外周血、腫瘤和脾臟分布均最高(p < 0.05,圖7A-D)。綜上所述,AK128-aPD1@M1m可以通過T細胞和NK細胞的協(xié)同調(diào)節(jié),充分激活免疫反應,誘導有效的免疫治療。同時通過ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、顆粒酶B水平(圖7E-G)發(fā)現(xiàn),AK128-aPD1@M1m組在所有組中顯示出三個指標的最高水平(p < 0.01)。


  簡而言之,該研究設(shè)計的仿生納米材料具有多個優(yōu)勢:1)亞磷酸鈉鹽封端的AK128與aPD1絡(luò)合并用M1m偽裝,形成了一種成分簡單、能夠延長血液循環(huán)時間且能跨越血腦屏障的納米藥物;2)具有免疫調(diào)節(jié)活性的AK128可以促進PBMCs中NK細胞的增殖,而遞送的aPD1可以通過ICB重新激活T細胞和NK細胞,促進腫瘤細胞凋亡,從而提高膠質(zhì)瘤的免疫治療效果,實現(xiàn)對免疫細胞的多重調(diào)節(jié),為腦膠質(zhì)瘤的免疫治療提供了一種新策略。


  以上研究成果以“Brain Delivery of Biomimetic Phosphorus Dendrimer/Antibody Nanocomplexes for Enhanced Glioma Immunotherapy via Immune Modulation of T Cells and Natural Killer Cells”為題,在線發(fā)表于國際著名期刊ACS Nano(DOI: 10.1021/acsnano.3c13088)。東華大學生物與醫(yī)學工程學院沈明武研究員、史向陽教授為共同通訊作者,東華大學碩士研究生彭亞敏為第一作者。該工作得到了國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學基金項目、上海市科學技術(shù)委員會項目和上海市教委領(lǐng)軍人才計劃等項目的資助。


  文章鏈接:https://doi.org/10.1021/acsnano.3c13088

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